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圖解blast驗證引物教程

——以文獻報道的人類的ABCG2的引物為例

1、進入網頁：/BLAST/

2、點擊BasicBLAST中的nucleotideblast選項

3、完成2操作后就進入了BasicLocalAlignmentSearchTool界面

（1）在EnterQuerySequence欄中輸入引物序列：

注：文獻報道ABCG2的引物為5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;

5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’

簡便的做法是同時輸入上下游引物。輸入上下游引物系列都從5’—3’。輸入上游引物后，

加上≥20個字母n，再輸入下游引物，如下圖：

生

物

秀

（2）在ChooSearchSet欄中：

Databa根據預操作基因的種屬定了，本引物可選Humangenomic+transcript

或Others(nretc.)。本人傾向于選后者，覺得此庫信息更多。如下圖：

（3）在ProgramSelection中：選擇Somewhatsimilarquences(blastn)項，如下圖：

（4）在此界面最下面：如下圖

生

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做

生

物

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w.

b

b

i

o

o

.

c

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m

Showresultsinanewwindow項是顯示界面的形式，可選可不選，在此我們選上了。關鍵

要點擊Algorithmparameters參數設置，進入參數設置界面。

4.參數設置：

（1）在GeneralParameters中：Expectthresshold期望閾值須改為1000，大于1000

也可以；在Wordsize的下拉框將數字改為7。如下圖：

（2）ScoringParameters無須修改

（3）FiltersandMasking中，一般來說也沒有必要改

5．點擊最下面一欄的BLAST按鈕，如圖：

6.點擊BLAST按鈕后，跳轉出現如下界面：

7.等待若干秒之后，自動跳轉出現顯示BLAST結果的網頁。該網頁用三種形式來顯示blast的

結果。

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心

做

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w

w.

b

b

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o

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c

o

m

（1）圖形格式：

圖中①代表這些序列與引物匹配的得分值小于40分

圖中②代表這些序列與引物匹配的得分值位于40～50分

圖中③代表這些序列與引物匹配的得分值位于80～120分，

分值越高，特異性越好。線段代表上或下游引物，其顏色和上面對照后就可得出該條引物的

分值。

圖中兩線段間有連線的代表這些序列與上游引物匹配（Strand=Plus/Plus）、并與下游引

物互補（Strand=Plus/Minus），理論上可以擴增出基因片斷。沒有連線的，表示單條引物與

該基因一致。

點擊線段，就能跳轉到該基因的結果信息概要。

（2）結果信息概要：

Accession、數據庫系列的身份證：點擊之后可以獲得該序列的信息

Desscription、系列的簡單描述

Totalscore高的就是有兩線段間有連線的，如圖劃線的。

Evalue：代表被比對的兩個序列不相關的可能性。【TheEvaluedecreaxponentiallyas

theScore(S)thatisassignedtoamatchbetweentwoquencesincreas】。E值最低的

最有意義，也就是說序列的相似性最大。設定的E值是我們限定的上限，E值太高的就不顯

示了

E、最后一欄有的有UEG的字樣，其中：

U代表：Unigene數據庫

E代表：GEOprofiles數據庫

G代表：Gene數據庫

（3）結果詳細信息：

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w.

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劃線上代表上游引物與該序列的正鏈【Plus/Plus】的匹配情況：

劃線下代表下游引物與該序列的負鏈【Plus/Minus】的匹配情況：

共有20個堿基匹配，得分40.1分【20×2＋0.1＝40.1】，E值為0.077。

為什么與上下游引物匹配的ABCG2序列有多種？

A、為同一個基因來源的不同的mRNA片段

B、為該基因的DNA系列

C、為同一個基因來源的不同的cDNA克隆片段。

結果判斷：

①驗證文獻報道的引物是否正確：如果你可以在所顯示的結果中找出你的目的基因，一般說

明你的引物正確性沒問題。如果你blast后沒有發現你的目的基因，或者分值很低，該引物就

可能不適合用

②檢測該對引物是否可與其它序列匹配，引起PCR的非特異性擴增。如果找到了你的目的

基因名稱，而且找到了一大批同物種的不同基因，（上下游引物分別搜索到相同的基因），而

且分數也較高。這時表明你的引物設計的特異性不高，極有可能在你的擴增產物中出現非特

異性產物。

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