wb步驟

實(shí)驗(yàn)原理

蛋白質(zhì)印跡是把電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固定基質(zhì)上，然后利用抗原抗體反

應(yīng)來(lái)檢測(cè)特異性的蛋白分子的技術(shù)，包括三個(gè)部分：SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳，

蛋白質(zhì)的電泳轉(zhuǎn)移，免疫印跡分析。

SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳主要用于測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量，SDS是陰離子

去污劑，能斷裂蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞其高級(jí)結(jié)構(gòu)。

SDS與大多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)合比為1.4:1，由于SDS帶有大量的負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)

結(jié)合時(shí)掩蓋了不同種類(lèi)蛋白質(zhì)間原有的電荷差別，使各種蛋白質(zhì)帶有相同密度的

負(fù)電荷，形似長(zhǎng)橢圓棒，蛋白遷移率與蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。

因此，利用相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以求得未知蛋白的相對(duì)分

子質(zhì)量。

電泳后蛋白質(zhì)分子嵌在凝膠介質(zhì)中，探針?lè)肿雍茈y通過(guò)凝膠孔，將蛋白質(zhì)從

凝膠轉(zhuǎn)移到固定基質(zhì)上可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫檢測(cè)分析。方法有兩種：①水平半

干式轉(zhuǎn)移即將凝膠和固定基質(zhì)似三明治樣夾在緩沖液浸濕的濾紙中間，通電

10~30min可完成②垂直濕式轉(zhuǎn)移即將凝膠和固定基質(zhì)夾在濾紙中間，浸在轉(zhuǎn)移

裝置的緩沖液中，通電2~4h或過(guò)夜可完成。固定基質(zhì)通常有硝酸纖維素膜、聚

偏二氟乙烯膜和尼龍膜。

蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固定化膜上之后，通過(guò)蛋白質(zhì)染料如麗春紅S檢測(cè)膜上的總蛋

白，或用考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)凝膠上的蛋白剩余量，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)移是否成功。用抗體作

為探針進(jìn)行特異性的免疫反應(yīng)檢測(cè)抗原蛋白，分為4步：①用非特異性、非反應(yīng)

活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由結(jié)合區(qū)，以防止作為探針的抗體結(jié)合

到膜上，出現(xiàn)檢測(cè)時(shí)的高背景②固定化膜用專(zhuān)一性的一抗溫育，使一抗與膜上的

抗原蛋白分子特異性結(jié)合③酶標(biāo)二抗與一抗特異結(jié)合④加入酶底物，適當(dāng)保溫，

膜上便可見(jiàn)到顏色反應(yīng)，檢測(cè)出抗原蛋白區(qū)帶。

主要溶液

10%分離膠

水3.3mL、30%丙烯酰胺混合液4.0mL、1.0mol/LTris（pH8.8）2.5mL、

10%SDS0.1mL、10%過(guò)硫酸銨0.1mL、TEMED0.004mL

5%濃縮膠

水2.7mL、30%丙烯酰胺混合液0.67mL、1.0mol/LTris0.5mL、

10%SDS0.04Ml/10%過(guò)硫酸銨0.04mL、TEMED0.004mL

1×Tris–甘氨酸電泳緩沖液

Tris堿3.03g、甘氨酸18.77g、SDS1g，用去離子水定容至1L

2×SDS凝膠加樣緩沖液

Tris-HCl（pH6.8）100mmol/L，β-巰基乙醇10%，10%甘油，0.01%溴酚

藍(lán)，10%SDS

轉(zhuǎn)移緩沖液

Tris2.45g，甘氨酸11.25g，甲醇100mL，加去離子水至1L

TBST

Tris1.21gNaCl8.77g，Tween-201mL，加去離子水至1L

Stripping

1.3mLTris（pH6.8），4mL10%SDS，140μlβ-巰基乙醇，用水定容到20mL

實(shí)驗(yàn)步驟

1SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳

⑴凝膠配置

①分離膠的配置：將配置好的分離膠液混勻后迅速倒入膠槽中，至距離短玻

璃板頂端約2cm處，停止灌膠。檢查是否有氣泡，若有用濾紙條吸出。然后在膠

液界面上加蒸餾水進(jìn)行水封。15~30min后，凝膠和水封層界面清晰，說(shuō)明膠已

經(jīng)聚合完全，然后用濾紙吸取水封層，濾紙切勿接觸到凝膠面。（使蛋白樣品分

離）

②濃縮膠的配置：將配置好的濃縮膠灌注在分離膠之上，直至短玻璃板的頂

端，然后插入樣品槽梳子。室溫下濃縮膠聚合，約20~30min。（使蛋白樣品濃縮）

⑵蛋白樣品的處理

將蛋白樣品溶于樣品溶解液，終濃度為0.5~1mg/ml。然后轉(zhuǎn)移到小離心管中，

輕輕蓋上蓋子（不能塞緊，以免加熱時(shí)液體迸出），在100℃沸水浴中加熱3min，

取出冷卻后備用，使用前需要將樣品離心除去顆粒物質(zhì)。暫時(shí)用不到的話，可放

在﹣20℃冰箱長(zhǎng)期保存，使用時(shí)沸水浴中加熱3min，以除去亞穩(wěn)聚合態(tài)物質(zhì)。

上樣前的樣品一定要均勻以防電泳時(shí)出現(xiàn)縱向條帶。

⑶加樣

拔去樣品槽梳子，倒入電極緩沖液，沒(méi)過(guò)短板約0.5cm以上，若樣品槽中有

氣泡，用槍頭挑除。按順序向凝膠樣品槽中加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白和未知蛋白樣品，每孔

的加樣量要相同，一般加樣體積為10~30μl，加樣時(shí)槍頭深入到加樣槽內(nèi)，盡量

接近底部，記錄加樣順序。

⑷電泳

上槽接負(fù)極，下槽接正極，打開(kāi)直流穩(wěn)壓電源，先80V過(guò)了濃縮膠后改為

120V，待溴酚藍(lán)指示劑遷移到凝膠下沿1cm時(shí)停止電泳。

2蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移

⑴水平半干式電轉(zhuǎn)移

①戴乳膠手套剪濾紙6張，濾紙長(zhǎng)與寬比SDS—PAGE膠各大1cm。

②裁剪與SDS—PAGE膠長(zhǎng)寬相等的NC膜。

③將3張濾紙和SDS—PAGE膠浸在負(fù)極轉(zhuǎn)移液中待用。

④將另3張濾紙和NC轉(zhuǎn)移膜浸在正極轉(zhuǎn)移液中待用。

⑤將浸在負(fù)極轉(zhuǎn)移液中的濾紙取出，盡量少帶液體，置于轉(zhuǎn)移槽負(fù)極上，然

后在負(fù)極濾紙上依次鋪放SDS—PAGE膠、NC膜、3張用正極轉(zhuǎn)移液飽和的濾紙。

注意排除氣泡，因?yàn)闅馀輹?huì)產(chǎn)生高阻抗點(diǎn)，形成低效印跡區(qū)，即所謂“禿斑”。

⑥蓋上石墨陽(yáng)極板，設(shè)定50mA恒流，轉(zhuǎn)移一定時(shí)間。

⑵垂直濕式轉(zhuǎn)移

①凝膠片的平衡：把電泳后的凝膠從玻璃板上轉(zhuǎn)移至成有適量轉(zhuǎn)移緩沖液的

大培養(yǎng)皿中，浸泡30~60min,以除去膠中的SDS，使其pH及離子強(qiáng)度和印跡緩沖

液相一致，防止凝膠發(fā)生膨脹或皺縮。

②將轉(zhuǎn)移緩沖液冷卻至4℃

③準(zhǔn)備N(xiāo)C膜和濾紙：戴乳膠手套裁剪與凝膠大小相同的NC膜和4張濾紙，

用轉(zhuǎn)移緩沖液浸潤(rùn)膜和濾紙15min，直到?jīng)]有氣泡，

④將海綿在轉(zhuǎn)移緩沖液中充分浸濕

⑤打開(kāi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移槽的轉(zhuǎn)移夾，依次放入：浸濕的海綿，兩張用轉(zhuǎn)移緩沖液

飽和的濾紙，用轉(zhuǎn)移緩沖液浸過(guò)的膠，NC膜，兩張用轉(zhuǎn)移緩沖液飽和的濾紙，

浸濕的海綿，然后合上轉(zhuǎn)移夾。

⑥轉(zhuǎn)移槽中倒入轉(zhuǎn)移緩沖液，然后將轉(zhuǎn)移夾置于槽中，凝膠靠近負(fù)極NC膜

靠近正極

將轉(zhuǎn)移槽放到4℃冰箱內(nèi)，電轉(zhuǎn)移，恒流80mA，4h。

3免疫印跡分析

⑴NC膜上總蛋白的染色和脫色：將電泳轉(zhuǎn)移完后的NC膜取出，置于培養(yǎng)皿中。

麗春紅S染色3min后，用鉛筆輕輕標(biāo)出標(biāo)準(zhǔn)蛋白帶的位置以備計(jì)算特異性蛋白

質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量所需。然后，用麗春紅S脫色液輕輕漂洗數(shù)次至紅色消失。

⑵特異性抗體檢測(cè)

①脫色后的NC膜置于培養(yǎng)皿中，加入封閉液，并在水平搖床上不斷振搖，

室溫下封閉2h以上。（將膜上未結(jié)合目的蛋白的區(qū)域封閉以防止一抗的結(jié)合）

②倒出封閉液，加入漂洗液，水平搖床上不斷振搖，洗膜3次，每次5min。

（除去封閉液）

③漂洗完后，將膜轉(zhuǎn)移至雜交袋中，加入特異性一抗，4℃搖床過(guò)夜或室溫

放搖3h（一抗與目的抗原蛋白特異性結(jié)合）

④利用水平搖床，用TBST洗膜3次，每次5min。（洗去未結(jié)合的一抗）

⑤將膜轉(zhuǎn)移到稀釋的酶標(biāo)二抗中，在室溫下孵育30min

⑥傾去二抗，用TBST洗膜，室溫?fù)u洗三次，每次5min，蛋白面朝上，置于

保鮮膜中，將ECL的A液和B液以1:1體積混合，于暗室中，按0.05-0.1ml/㎝

2的量滴加于膜表面，孵育1min，濾紙吸去多余液體用保鮮膜包好，立即于暗室

內(nèi)曝光數(shù)秒。

在暗室中，將1×顯影液和定影液分別到入塑料盤(pán)中；在紅燈下取出X－光

片，剪裁適當(dāng)大小（比膜的長(zhǎng)和寬均需大1cm）；打開(kāi)X-光片夾，把X－光片放

在膜上，一旦放上，便不能移動(dòng)，關(guān)上X-光片夾，開(kāi)始計(jì)時(shí)；根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱

適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，一般為1min或5min，曝光完成后，打開(kāi)X-光片夾，取出

X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時(shí)間

一般為1～2min（20～25℃），溫度過(guò)低時(shí)（低于16℃）需適當(dāng)延長(zhǎng)顯影時(shí)間；

顯影結(jié)束后，馬上把X-光片浸入定影液中，定影時(shí)間一般為5～10min，以膠片

透明為止；用自來(lái)水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。

注意事項(xiàng)

①在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性；

②不同濃度的凝膠用于分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白

③選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和

共價(jià)鍵、二硫鍵；對(duì)于多亞基蛋白或含多條肽鏈的蛋白，SDS—PAGE只能測(cè)定它

們的亞基或單條肽鏈的相對(duì)分子質(zhì)量。

④盡量除去核酸、多糖、脂類(lèi)等干擾分子；

⑤蛋白質(zhì)樣品在處理過(guò)程中應(yīng)低溫下進(jìn)行，以避免細(xì)胞破碎釋放出各種酶對(duì)

其進(jìn)行修飾

⑥盡量使用新鮮的loadingbuffer，樣品要與loadingbuffer混合均勻，

⑦不可將蛋白質(zhì)反復(fù)凍融使用以防改變蛋白質(zhì)的抗原特性，

⑧Buffer一定要漫過(guò)梳子孔，否則可能會(huì)發(fā)現(xiàn)蛋白跑不動(dòng)；

⑨電泳時(shí)先用低電壓跑過(guò)濃縮膠，再換高電壓跑分離膠，特別是對(duì)于高分子

量的目的蛋白，

⑩硝酸纖維素（NC)膜：NC與蛋白質(zhì)靠疏水作用結(jié)合，無(wú)需預(yù)先活化，對(duì)蛋

白質(zhì)的活性影響??；非特異性本底顯色淺；價(jià)格低廉，使用方便。但結(jié)合在NC

上的小分子蛋白質(zhì)在洗滌時(shí)易丟失；NC韌性較差，易損壞。

聚偏二氟乙烯(PVDF)膜：與蛋白質(zhì)親和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化

膜上的正電基團(tuán)，使其更容易與帶負(fù)電荷蛋白結(jié)合。但價(jià)格上稍貴。

為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小要先將膜晾

干，然后浸入20%的甲醇，待完全浸濕后取出透光觀察即可看到蛋白條帶（適用

于PVDF膜）。傳統(tǒng)方法是將膜用1×麗春紅染液染5min（于脫色搖床上搖），然

后用水沖洗掉沒(méi)染上的染液就可看到膜上的蛋白。

從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易

產(chǎn)生較高的背景。高背景可能的原因：膜未均勻浸泡；膜或緩沖液污染；封閉

不充分；抗體與封閉液出現(xiàn)交叉反應(yīng)；抗體濃度過(guò)高。解決方法有：轉(zhuǎn)膜前用

100%甲醇將膜完全浸泡；雜交前檢測(cè)一抗、二抗；檢測(cè)一抗、二抗與封閉液是否

有交叉反應(yīng)。

轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，通常分子量最大的

1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液對(duì)膜進(jìn)行染色，

以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮藍(lán)快速染色液對(duì)完成轉(zhuǎn)膜的

SDS-PAGE膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情況。

作用

定性分析蛋白質(zhì)，特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測(cè)和測(cè)定蛋白質(zhì)分子量，分析目

的蛋白表達(dá)的特異性。

蛋白樣品的制備

（1）單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。?/p>

1、倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵?/p>

直立放置一會(huì)兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。

2、每瓶細(xì)胞加3ml4℃預(yù)冷的PBS（0.01MpH7.2～7.3）。平放輕輕

搖動(dòng)1min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以

洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。

3、按1ml裂解液加10μlPMSF（100mM），搖勻置于冰上。（PMSF

要搖勻至無(wú)結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。）

4、每瓶細(xì)胞加400μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，為使

細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來(lái)回?fù)u動(dòng)。

5、裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動(dòng)作要快），

然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。（整個(gè)操作盡量在冰

上進(jìn)行。）

6、于4℃下12000rpm離心5min。（提前開(kāi)離心機(jī)預(yù)冷）

7、將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移到離心管中放于－20℃保存。

（2）組織中總蛋白的提?。?/p>

1、將少量組織塊置于1～2ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組

織塊盡量剪碎。

2、加400μl單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中，進(jìn)行勻漿。

然后置于冰上。

3、幾分鐘后再碾一會(huì)兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。

4、裂解30min后，即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中，然

后在4℃下12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于－20℃

保存。

（3）加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提取：

由于受藥物的影響，一些細(xì)胞脫落下來(lái)，除了按（一）操作外還應(yīng)收

集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提?。?/p>

1、將培養(yǎng)液倒至15ml離心管中，于2500rpm離心5min。

2、棄上清，加入4mlPBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500rpm離心

5min。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。

3、用槍洗干上清后，加100μl裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，

裂解過(guò)程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。

4、將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm離心5min，取

上清分裝于0.5ml離心管中并置于－20℃保存。

（三）蛋白含量的測(cè)定

（1）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

1、從－20℃取出1mg/mlBSA，室溫融化后，備用。

2、取18個(gè)1.5ml離心管，3個(gè)一組，分別標(biāo)記為0mg，2.5mg，5.0mg，

10.0mg，20.0mg，40.0mg。

3、按下表在各管中加入各種試劑。

0

mg

2.5mg5.0mg

10.0m

g

20.0m

g

40.0m

g

1mg/mlBSA－2.5ml5.0ml

10.0m

l

20.0m

l

40.0m

l

0.15mol/LNaCl

100m

l

97.5m

l

95.0m

l

90.0m

l

80.0m

l

60.0m

l

G250考馬斯亮藍(lán)溶

液

1ml1ml1ml1ml1ml1ml

4、混勻后，室溫放置2min。在生物分光光度計(jì)上比色分析。

（2）檢測(cè)樣品蛋白含量

1、取若干1.5ml離心管，每管加入4℃儲(chǔ)存的考馬斯亮藍(lán)溶液1ml。

室溫放置30min后即可用于測(cè)蛋白。

2、取一管考馬斯亮藍(lán)加0.15mol/LNaCl溶液100ml，混勻放置2分

鐘可做為空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的程序下按blank

測(cè)空白樣品。

3、棄空白樣品，用無(wú)水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用無(wú)

菌水洗一次。

4、取一管考馬斯亮藍(lán)加95ml0.15mol/LNaClNaCl溶液和5ml待測(cè)

蛋白樣品，混勻后靜置2min，倒入扣干的比色杯中按sample鍵測(cè)樣品。

注意：每測(cè)一個(gè)樣品都要將比色杯用無(wú)水乙醇洗2次，無(wú)菌水洗

一次。可同時(shí)混合好多個(gè)樣品再一起測(cè)，這樣對(duì)測(cè)定大量的蛋白樣品可節(jié)

省很多時(shí)間。測(cè)得的結(jié)果是5ml樣品含的蛋白量。

主要參考

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教程劉箭主編

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)魏群主編

還有百度上搜的關(guān)于wb的方法步驟及試驗(yàn)中出現(xiàn)的問(wèn)題

熱致相分離法的英文縮寫(xiě)TIPS，是ThermallyInducedPha

Separation的簡(jiǎn)稱(chēng).原理是在聚合物的熔點(diǎn)以上，將聚合物溶于高沸點(diǎn)，低

揮發(fā)性的溶劑（又稱(chēng)稀釋劑）中，形成均相溶液。然后降溫冷卻。在冷卻

過(guò)程中，體系會(huì)發(fā)生相分離。這個(gè)過(guò)程分兩類(lèi)，一類(lèi)是固－液相分離（簡(jiǎn)

稱(chēng)S-L相分離），一類(lèi)是液－液相分離（L-L相分離）。控制適當(dāng)?shù)墓に嚄l

件，在分相之后，體系形成以聚合物為連續(xù)相，溶劑為分散相的兩相結(jié)構(gòu)。

這時(shí)再選擇適當(dāng)?shù)膿]發(fā)性試劑（即萃取劑）把溶劑萃取出來(lái)，從而獲得一

定結(jié)構(gòu)形狀的聚合物微孔膜。與NIPS法相比，TIPS有許多優(yōu)點(diǎn)：它通過(guò)較

為迅速的熱交換促使高分子溶液分相，而不是緩慢的溶劑一非溶劑交換；

TIPS法避免了NIPS法（非溶劑致相分離法）由于存在溶劑一非溶劑交換，

導(dǎo)致成膜液中部分溶劑參與了聚合物的凝膠化，所以孔隙率低的缺點(diǎn)；TIPS

法可用于難以采用NIPS法制備的結(jié)晶性聚合物微孔濾膜的制備，而且TIPS

法的影響因素要比NIPS法少，更容易控制；由TIPS法可獲得多種微觀結(jié)

構(gòu)，如開(kāi)孔，閉孔，各同向性，各異向性，非對(duì)稱(chēng)等。

2熱致相分離制膜步驟

TIPS法制備微孔膜的步驟主要有溶液的制備（可連續(xù)也可間歇制備）、

膜澆注和后處理3步。具體操作為：（1）聚合物與高沸點(diǎn)、低分子量的液

態(tài)或固態(tài)稀釋劑混合，在高溫時(shí)形成均相溶液；（2）將混合物溶液制成所

需要的形狀（平板、中空纖維或管狀）；（3）冷卻溶液使其發(fā)生相分離；

（4）除去稀釋劑（常用溶劑萃?。?；（5）除去萃取劑（蒸發(fā)）得到微孔

結(jié)構(gòu)。