核衣殼

貓傳染性腹膜炎病毒核衣殼蛋白的表達及間接ELISA法的建

立

熊煒;林穎崢;王艷;魏曉鋒;王巧全;黃忠榮;胡建華;李健

【摘要】本研究對貓傳染性腹膜炎病毒（FIPV）N蛋白的編碼基因進行克隆和原

核表達，并在純化重組N蛋白的基礎上，建立了FIPV抗體間接ELISA檢測方法。

研究結果顯示，該重組純化的N蛋白具有良好的抗原反應性，可用于FIPV陽性血

清的篩查，為我國出入境檢疫部門監控FIPV疫情提供技術支撐。%Inthis

study,thegeneofnucleocapsidprotein(Nprotein)offelineinfectious

peritonitisvirus(FIPV)

indirectELISAmethodwastablishedwiththepurifiedrecombi-nantN

ultsshowedthisrecombinantNproteinhadperfect

antigenreactivityofFIPVandcouldbeudtoscreenFIPVpositive

rum,andthestudywashelpfultomonitortheFIPVinfectionstatus.

【期刊名稱】《中國動物檢疫》

【年(卷),期】2014(000)002

【總頁數】4頁(P67-70)

【關鍵詞】貓傳染性腹膜炎病毒;核衣殼蛋白;基因克隆和表達;間接ELISA

【作者】熊煒;林穎崢;王艷;魏曉鋒;王巧全;黃忠榮;胡建華;李健

【作者單位】上海出入境檢驗檢疫局，上海200135;上海出入境檢驗檢疫局，上

海200135;上海出入境檢驗檢疫局，上海200135;上海實驗動物研究中心，上海

201203;上海出入境檢驗檢疫局，上海200135;上海出入境檢驗檢疫局，上海

200135;上海實驗動物研究中心，上海201203;上海出入境檢驗檢疫局，上海

200135

【正文語種】中文

【中圖分類】S852.659.6;S858.293

貓傳染性腹膜炎（FIP）是由貓傳染性腹膜炎病毒（FIPV）引起的貓科動物的一種

慢性、漸進性、致死性傳染病，以腹膜炎、大量腹水積聚或各種臟器出現肉芽腫病

變、致死率較高為主要臨床特征[1-2]。FIPV在分類上屬于套式病毒目

（Nidovirus）冠狀病毒科冠狀病毒屬，它與貓腸道冠狀病毒（FECV）同屬于貓

冠狀病毒（FCoV）[3]。FIPV的基因型為單股正鏈不分節段的RNA病毒，病毒粒

子呈螺旋狀對稱，有囊膜，囊膜表面有花瓣狀纖突，在電子顯微鏡下呈日冕狀。

FIPV編碼4種主要結構蛋白，即刺突蛋白（S蛋白）、膜蛋白（M蛋白）、小包

膜蛋白（E蛋白）和核衣殼蛋白（N蛋白）[3]。1963年Holzworth在美國首次

報道本病，但直到1977年才確定該病病原為冠狀病毒。目前已報道的檢測FIPV

的方法有血清學檢測、RT-PCR、核酸探針檢測、基因芯片檢測等[4-10]。本研究

對FIPVN蛋白基因編碼序列進行克隆和原核表達，并將其純化后包被ELISA板，

初步建立了FIPV抗體間接ELISA檢測方法。

1.1主要試劑Trizol、逆轉錄酶（SuperscriptII）購自Invitrogen公司；高保

真Taq酶（PfuultraII）購自Stratagene公司；RNA酶抑制劑、dNTP、DNA

Marker（DL2000、DL15000）、蛋白Marker、T4DNA連接酶購自Takara

公司；限制性內切酶BamHI和NotI購自NEB公司；胰蛋白胨、酵母提取物購

自Oxid公司；大腸桿菌感受態細胞（Top10F和BL21）、氨芐青霉素、質粒抽

取試劑盒、膠回收試劑盒、TMB試劑均購自天根生化公司；蛋白表達產物純化采

用GE公司的HisTrapHP親和柱及試劑。

1.2病毒FIPV由本室從美國菌種保藏中心（ATCC編號：FIPV-1145）引進并

保存。將該病毒在狗直腸瘤細胞系（A72）上擴增，細胞培養物凍融，3000

r/min離心，取上清液備用。

1.3引物參照GenBank中收錄的FIPV毒株的N蛋白基因序列設計引物并在

該基因的上下游分別引入BamHI和NotI內切酶位點，擴增的N蛋白基因大小

為1134bp，其上游引物（FIPVNF）為：5’CGGGATCCATGGCCACAC

AGGGACAACGCGTC3’，下游引物（FIPVNR）為：5’CCGCTCGAGGTT

CGTAACCTCATCAATCATCTC3’。

1.4RNA抽提和目的基因擴增取200μLFIPV細胞培養物上清液，加1mL

Trizol試劑，用槍吹打20～30次；加入200μL氯仿，渦旋震蕩30s混勻；

12000r/min離心15min；取上層水相，加500μL異丙醇，顛倒混勻，-20℃放

置20min；12000r/min離心10min；棄上清，沉淀用1mLDEPC水配制的

75%乙醇清洗；7500r/min離心10min；棄上清，沉淀室溫干燥10min；加

20μLDEPC水溶解RNA沉淀。取10μLRNA溶液，加5倍逆轉錄酶濃縮緩沖

液4μL、0.1MDTT（二硫蘇糖醇）2μL、dNTP1μL、下游引物（FIPVNR）1

μL、RNA酶抑制劑1μL、逆轉錄酶（SuperscriptII）1μL，置PCR儀上

42℃/50min、70℃/15min即得cDNA模板。在PCR管中，加cDNA模板3

μL、10倍Taq酶濃縮緩沖液5μL、dNTP2μL、上下游引物（FIPVNF和

FIPVNR）各0.5μL、Taq酶（PfuultraII）1μL，加水補足總體積至50μL。將

PCR管置PCR儀上，按如下程序擴增：首先94℃5min；然后94℃30s，56℃

30s，72℃90s，30個循環；最后72℃5min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒

定。

1.5膠回收和質粒的抽提PCR產物和質粒載體經BamHI和NotI酶切后，采

用天根生化公司膠回收試劑盒進行基因片段的回收，方法見試劑盒說明書；質粒抽

提采用天根生化公司質粒提取試劑盒，方法見試劑盒說明書。

1.6目的基因連接至質粒載體質粒載體（pET23a）與PCR產物連接采用

Takara公司T4DNA連接酶，操作見試劑說明書。

1.7表達產物的SDS-PAGE電泳和Western-blots檢測取500μL37℃培養

過夜的菌液，6000r/min離心5min，得細菌沉淀懸浮于50μLPBS中，加入蛋

白上樣緩沖液后，煮沸裂解后進行SDS-PAGE電泳（膠濃度12%），分析蛋白電

泳條帶。將表達的蛋白產物，用HisTrapHP親和柱純化后，進行蛋白電泳，并將

蛋白轉印至硝酸纖維素膜上，再使用FIPV陽性血清和用辣根過氧化物酶標記的羊

抗貓HRP-IgG作為二抗，進行Western-blot，檢測重組蛋白的生物學活性。

1.8His蛋白的純化通過pET23質粒載體在大腸桿菌表達的FIPVN蛋白末端

引入組氨酸（His）的標記，采用GE公司生產的HisTrapHP對目的蛋白進行純

化，具體操作見說明書。

1.9抗原包被濃度與陽性血清稀釋度的確定以純化的重組蛋白為包被抗原，采用

方陣試驗方法，優化抗原包被濃度和陽性血清稀釋濃度。取純化FIPVN蛋白（濃

度測定為4.66μg/mL），用pH8.6磷酸鹽按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、

1∶64、1∶128進行倍比稀釋，再包被96孔ELISA板，每孔200μL，4℃過夜；

用PBST洗滌三次；每孔加入200μL40g/LPEG20000作為封閉液，37℃封閉

2h；用PBST洗滌三次；將FIPV陽性血清和陰性血清分別按1∶100、1∶200，

1∶400稀釋后，加入酶標板，每孔100μL，37℃作用lh；用PBST洗滌三次；

加入1∶2000稀釋的羊抗貓HRP-IgG，每孔100μL，37℃作用1h；用PBST洗

滌三次；加TMB底物顯色液，每孔100μL，37℃作用15min；最后每孔加入

100μL2mol/LH2SO4終止反應；在酶標儀上450nm處讀取OD值。以陽性

血清的OD值接近1.0，P/N值（陽性血清OD450/陰性血清OD450）≥2.0的抗

原最大稀釋度作為抗原的最適工作濃度。

2.1目的基因的RT-PCR擴增將FIPV毒株在A72細胞上擴增，提取細胞培養

物中的RNA，采用RT-PCR對FIPV的N蛋白基因進行擴增，通過引物將在目的

基因的5’端和3’端分別引入BamHI和NotI限制性內切酶位點。結果顯示，

經RT-PCR從FIPV基因組中擴增出了條帶單一特異性的基因片段，基因片段大小

為1148bp（去除終止子，并引入17bp的內酶切位點）（圖1）。

2.2目的基因的克隆及產物的酶切鑒定將目的基因PCR產物進行膠回收后，用

BamHI和NotI進行雙酶切，將其與同樣進行酶切的質粒載體pET23a進行連接，

后轉化大腸桿菌感受態細胞Top10F。經平板篩選，挑取陽性克隆進行質粒抽提和

酶切鑒定。結果顯示，隨機挑取的2個平板篩選陽性克隆（pET-23a-FIPV-N1和

pET-23a-FIPVN2）的質粒經酶切鑒定均釋放出了與目的基因大小一致的陽性基因

片段（圖2），將質粒進行核酸序列測定并與報道的FIPV株N蛋白基因

（Genbank登錄號：AB086881）比對，其同源性為95.2%。

2.3目的基因的表達及抗原性鑒定將pET-23a-FIPV-N1質粒轉化大腸桿菌感

受態細胞BL21，轉化細菌搖菌培養6h后，加入終濃度為1.0mmol/L的IPTG

進行誘導表達，蛋白表達產物用SDSPAGE分析。結果顯示，與空載體對照及未

經IPTG誘導表達的目的質粒轉化細菌蛋白電泳圖相比，pET-23a-FIPV-N1轉化

的細菌經IPTG誘導后，其電泳蛋白譜中出現了分子量大小為45Kda的目的基因

表達產物（圖3）。將表達的目的蛋白產物，用HisTrapHP親和柱純化后，進行

SDS-PAGE電泳、轉膜，并使用FIPV陽性血清進行Western-blot分析，證實電

泳蛋白譜中出現的45Kda的重組蛋白具有良好的FIPV蛋白的反應原性（圖4）。

2.4FIPV間接ELISA檢測方法的建立經方陣實驗測定，建立的FIPV間接

ELISA檢測方法中，當FIPV陽性血清為l∶100稀釋、FIPVN蛋白抗原的最佳包

被濃度為1.17μg/mL（稀釋倍數1∶4）時，陽性血清的OD值接近于1.0，而陰

性血清的OD值均較低，分布于0.05～0.2之間（表1）。因此，確定FIPV陽性

血清的最佳工作濃度為1∶100，相應的FIPVN蛋白抗原的最佳包被濃度為1.17

μg/mL。

貓傳染性腹膜炎在貓群發病率、死亡率均較高，尤其在多貓家庭和流浪貓聚集地多

發。該病在感染早期無特征性癥狀，出現臨床癥狀后，預后多不良，目前RT-PCR

是檢測該病最常用的方法。國內對該病的研究不多，報道的FIPV的檢測方法有限。

由于FIPV是冠狀病毒屬的重要成員，尤其在2004年肆虐全球的“非典”（SARS）

之后，人們對冠狀病毒的研究越來越重視。據報道，SARS是由一種新型的冠狀病

毒（SARS-CoV）引起，它很有可能來源于果子貍，該動物分類上屬于靈貓科動物

[11]。因此，監控貓科動物特別是野生貓科動物中FIPV的疫情，對控制FIPV的

傳播，具有重要的公共健康安全意義。此外，由于FIPV易變異，血清型較多，而

其主要結構蛋白之一的N蛋白基因相對保守，可做為核酸檢測和血清學檢測的良

好靶點。基于上述背景，在已建立了FIPV核酸檢測方法的基礎上[5，10]，為豐

富FIPV檢測技術體系，本研究對FIPV編碼的N蛋白基因進行了克隆和原核表達，

并將重組N蛋白包被ELISA板，初步建立了FIPV抗體間接ELISA檢測方法，該

體外重組N蛋白具有良好的抗原反應性，可用于FIPV陽性血清的篩查。后繼，本

研究將采用更多的臨床樣本對建立的FIPV間接ELISA方法進行優化，并對方法的

特異性、穩定性和可靠性做進一步驗證。總之，該FIPV抗體間接ELISA檢測方法

的建立，為出入境口岸監控和診斷進境的犬貓科動物特別是貓科野生動物中FIPV

疫情提供了重要的技術支撐。

【相關文獻】

[1]OlnCW．Areviewoffelineinfectiousperitonitisvirus：molecularbiology，

immunopathogenesis，clinicalaspects，andvaccination[J]．VetMicrobiol，1993，36

（1/2）：1-37．

[2]EvermannJF，McKeirnanAJ，OttRL．Perspectivesontheepizootiologyoffeline

entericcoronavirusandthepathogenesisoffelineinfectiousperitonitis[J]．VetMicrobiol，

1991，28（3）：243-255．

[3]MyrrhaLW，SilvaFM，PeternelliEF，etal．Theparadoxoffelinecoronavirus

pathogenesis：areview[J]．AdvVirol，2011：109849.

[4]喬明明，董悅農，楊萬蓮，等．貓傳染性腹膜炎的診斷[J]．實驗動物科學，2007，24（5）：

27-29．

[5]李健，陳沁，王權，等．貓冠狀病毒和貓傳染性腹膜炎病毒RT-PCR檢測方法的建立[J]．畜牧

與獸醫，2006，38（11）：32-34．

[6]SimonsFA，VennemaH，RofinaJE，etal．AmRNAPCRforthediagnosisoffeline

infectiousperitonitis[J]．JVirolMethods，2005，124（1/2）：111-116．

[7]PratelliA，TempestaM，GrecoG，etal．DevelopmentofanestedPCRassayforthe

detectionofcaninecoronavirus[J]．JVirolMethods，1999，80（1）：11-15．

[8]MartinezML，WeissRC．Detectionoffelineinfectiousperitonitisvirusinfectionin

cellculturesandperipheralbloodmononuclearleukocytesofexperimentallyinfectedcats

usingabiotinylatedcDNAprobe[J]．VetMicrobiol，1993，34（3）：259-271．

[9]SomaT，IshiiH．Detectionoffelinecoronavirusantibody，felineimmunodeficiency

virusantibody，andfelineleukemiavirusantigeninascitesfromcatswitheffusivefeline

infectiousperitonitis[J]．JVetMedSci，2004，66（1）：89-90．

[10]李健，熊煒，陳沁，等．犬貓3種冠狀病毒基因克隆的構建與芯片檢測技術[J]．中國獸醫學

報，2008，28（11）：1284-1287．[11]ShiZ，HuZ．Reviewofstudiesonanimal

rervoirsoftheSARScoronavirus[J].VirusRes，2008，133（1）：74-87.