噬菌體展示技術

體外（exvivo）體內（invivo）噬菌體展示技術—有望助力研

發新一代腫瘤治療抗...

基于單克隆抗體(mAb)的腫瘤免疫治療,尤其是針對免疫細胞檢驗

點的調節治療，在近些年來被認為是最具潛力和最受矚目的腫瘤治療

策略之一。據統計，截至2018年，FDA共批準31款腫瘤治療單抗藥

物，其中7款單抗藥物用于治療血液性腫瘤，24款單抗藥物用于治療

實體瘤。在24款治療實體瘤的單抗藥物中，有9款單抗靶向了6種不

同的CD抗原(包括CD19,CD20,CD30,CD33,CD38和CD53)，13款

單抗靶向腫瘤細胞表面分子(HER2,EGFR,PD-L1,GD2,PMSA,以

及SLAMF7)，還有3款單抗靶向免疫細胞表面抑制性受體PD-1和

CTLA-4，用于激活免疫反應，剩余的單抗主要用于抑制腫瘤血管生成

1)。這些數據表明，目前可以用于單抗治療藥物研發的靶點是非常有

限的，并且其中的大部分靶點也同時表達在正常的組織中,這意味著在

單抗治療中將會引入一定的副作用。因此，如何找到新的篩選方法用

于發現新的腫瘤特異性抗原，尤其是在腫瘤組織中表達量低，但卻發

揮重要作用的抗原，以及靶向這些抗原的抗體，對于擴大單抗在腫瘤

治療領域中的應用具有重要的意義。

本文將要介紹的體外(exvivo)/體內(invivo)噬菌體展示技術，

主要目的就是為了找到更多的腫瘤特異性抗原及靶向抗原的抗體。這

些抗原應該具有的特點包括：低豐度；表達在罕見的亞細胞群表面；

特異地存在于腫瘤微環境中。因此有望為開發新一代腫瘤治療抗體提

供幫助。

那么這些新的篩選體系是怎么做到的呢？

我們知道，鑒定腫瘤抗原的傳統方法是在DNA,RNA和蛋白質水

平上尋找腫瘤和非腫瘤細胞的區別2)。這依賴于有效生物原材料的獲

取，比如細胞系和臨床樣品。然而，抗原在細胞系表面的表達水平并

不能代表其在腫瘤組織中的表達水平。有研究表明，一些細胞表面表

達的分子在從體內分離到體外的過程中會失去其上調表達的特征，從

而會導致一些潛在靶點的丟失3)。另一方面，新鮮分離的臨床樣品很

難達到傳統篩選技術所需的含量。即使人源腫瘤組織樣品可以在免疫

缺陷的小鼠中獲取，鼠源的基質細胞也會影響人源腫瘤細胞表面分子

的表達模式4)。另一個不得不考慮的問題，在傳統篩選方法中，樣品

需要經過一系列復雜的處理，這會導致細胞形態結構的改變，也不利

于篩選到潛在的腫瘤靶點。

為了使篩選的環境盡可能地接近腫瘤細胞所處的微環境，保留腫

瘤細胞表面分子的表達模式，發現更多新的重要的腫瘤相關抗原和抗

體，科研工作者們進行了不斷的嘗試和改進。這些新的方法可以用于

新鮮分離的腫瘤組織，腫瘤病人的體液，以及荷瘤小鼠和癌癥病人體

內。下文將予以一一介紹。

1來自體內的體外(exvivo)噬菌體篩選

1）組織切片篩選

組織切片篩選的核心步驟包括：獲取新鮮的腫瘤組織樣品→制備

冰凍切片或石蠟切片→用激光捕獲切割方法從切片上獲取感興趣的細

胞區域→將捕獲的目標細胞與噬菌體抗體庫共孵育→通過微量移液器

和特殊的過濾杯轉移和清洗非特異性結合的噬菌體→洗脫，侵染和涂

板5,6)。組織切片篩選將激光捕獲切割方法和傳統的噬菌體篩選相結

合，具有以下優點：①通過激光捕獲切割可以獲得感興趣的背景相對

純凈的細胞群，并且不對細胞造成傷害。②組織處于接近天然的狀態。

③該方法所需的最小細胞數目可以低至20-30個，大部分的腫瘤組織

樣品可以滿足。這使得它可以被廣泛用于針對各種腫瘤組織的篩選。

該方法的不足在于它還是只能對多細胞群進行篩選，并且組織需要經

過體外的處理。

2）shadow-stick篩選

這是一項針對單個細胞進行的篩選技術。篩選的流程如圖1所示。

首先將含有目標細胞的異質細胞懸液鋪在玻璃片上，用固定液固定細

胞，使細胞在篩選和漂洗過程不被洗脫下來。接著將細胞與噬菌體庫

共孵育，洗去玻片表面游離的噬菌體。然后將玻片用紫外光照射，同

時通過顯微操作用類似冰球棒的裝備將靶細胞和結合在目標細胞上的

噬菌體保護起來。這樣紫外光將使結合在非靶細胞上的噬菌體的DNA

與所結合細胞發生交聯，從而使它們失去在大腸桿菌中復制的能力，

最后能夠生長起來的克隆就只剩下結合在目標細胞表面的噬菌體克隆。

一般對于一個細胞可以獲得1-10個克隆7)。不難看出，這個方法最大

的優點是可以對一個細胞進行篩選，適用于靶細胞出現頻率極低的情

況。比如循環系統中的惡性腫瘤細胞，它們出現的概率只占外周血單

核細胞的百萬分之一。并且從另一角度來說，靶細胞出現的頻率越低，

結合細胞表面共同表位的克隆就更有可能被非靶細胞中和，從而提高

篩選到結合靶細胞表面特異分子的克隆的概率。

圖1：Shadow-stick篩選方法流程圖

2體外和體內(invivo)相結合的噬菌體篩選

早在1996年，就已經有科研工作者嘗試用體內噬菌體篩選技術鑒

定器官和腫瘤的標記物8)。隨后，也有不少研究者跟隨前人的腳步進

行體內噬菌體篩選的試驗，其中既包括在動物模型體內，也包括在病

人體內9-11)，但大多都不了了之。其原因在于，相比于體外，體內

篩選要面臨更高背景的非特異性結合，而且后期的數據分析和體內驗

證要耗費很大的精力。2013年，Sa′nchez-Mart?′n等人為獲得腫瘤

歸巢抗體而進行的體內和體外相結合的噬菌體篩選12)，是本人認為值

得介紹的工作。如圖2所示，為了富集到更多可以結合腫瘤組織，而

不是血管和基質細胞的抗體，研究者首先用處理過的腫瘤組織在體外

進行了一輪富集篩選實驗，這也可以減少體內篩選所需要的小鼠數目。

隨后，將體外富集的抗體庫通過靜脈注射使其在荷瘤小鼠體內循環

24h。然后取出腫瘤組織，洗脫下結合的噬菌體，測序和分析抗體序

列。最后再在小鼠體內驗證抗體的特異性，以及利用層析和質譜技術

鑒定抗體所識別的靶點分子。通過本次實驗，工作者找到了一株可以

特異識別原發性和轉移性胰腺癌的抗體，其識別的靶分子是一個蛋白

酶體的激活復合體PA28。后續的驗證結果表明PA28可以作為胰腺癌

的標記分子12)。

不得不說，通過體內篩選來找到識別腫瘤細胞表面特異分子及其

抗體的前景是誘人的。其最顯著的特點，是解決了傳統體外篩選需要

面臨的一個嚴重的問題，即抗體不能很好地到達腫瘤組織內部，或者

到達腫瘤微環境的抗體失去了它的效應功能。通過體內篩選獲得的抗

體，至少保證了抗體是可以通過血液運輸到達腫瘤微環境中的。然而，

要想真正將體內篩選作為一種普遍使用的篩選方法，仍然面臨很大的

挑戰。例如，需要解決高背景非特異性結合的技術瓶頸；另外，急需

尋找合適的抗體展示介質以使抗體能夠更好地穿透內皮屏障，選擇性

地分布在腫瘤組織內部。因為噬菌體并不是一個可以很好穿透內皮屏

障的介質，而且有被機體免疫系統攻擊的風險。

圖2：體外和體內相結合的噬菌體篩選流程示意圖

在最后，本人總結了傳統的體外噬菌體篩選技術和新一代噬菌體

篩選技術的優缺點，如下表所示。

篩選方法優點缺點應用

體外噬菌

體篩選

體系成熟操作過程可

控；

較易篩選到高親和力

及有特定功能的抗

體；

后期功能驗證工程量

小。

只適用于抗原已知

的篩選；體外抗原

的表達情況與體內

有差距，可能導致

抗體在體內無法發

揮功能。

針對已知抗原篩

選高親和力抗

體。

切片篩選利用激光捕獲技術，

可以針對感興趣的細

胞群進行篩選，樣品

量需求小。

不能對單個細胞進

行篩選；背景相對

較高；樣品經過體

外處理，可能細胞

表面分子形態的改

變；對操作要求

高。

針對表達共同表

面分子的目標細

胞群進行篩選，

有望發現新的腫

瘤相關抗原。

Shadow-

stick篩選

針對單個細胞進行篩

選，適合對出現頻率

極低的細胞亞群進行

篩選；樣品量需求

小；篩選過程較為簡

單。

不適用于對常見的

細胞進行篩選。

篩選特異識別單

個細胞表面的抗

原。

體內/體外

結合的噬

菌體篩選

相當于以體內的環境

作為抗原庫，更能反

應真實的抗原表達情

況；有利于篩選到能

夠浸潤腫瘤微環境的

抗體。

非常高的非特異結

合；篩選過程及后

期驗證需要耗費較

大的精力。

開發新的腫瘤標

記物和腫瘤歸巢

抗體。

結語

如何找到更多的腫瘤相關抗原和靶向抗原的抗體是開發新一代腫

瘤治療方法需要解決的技術瓶頸。體外/體內噬菌體篩選技術相比于直

接靶向已知抗原的體外噬菌體篩選技術，在發現新的腫瘤抗原和腫瘤

歸巢抗體方面具有突出的優勢。然而，不得不承認，雖然經過了很多

科研工作者的共同努力，新一代的篩選技術要真正地普及到普通的實

驗室中，建立起成熟的體系，仍然需要更多人的努力。

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