糖蛋白

糖蛋白的結構、功能及分析方法

武金霞 趙曉瑜

(河北大學生命科學學院,保定071002)

摘 要: 綜述了糖蛋白研究的重要意義、糖肽鍵的主要類型、糖鏈的主要類型、糖蛋白結構研究的一般策略

及結構分析的最新進展。

關鍵詞: 糖蛋白 糖鏈 結構分析

StructureFunctionandAnalysisMethodsofGlycoprotein

WuJinxia ZhaoXiaoyu

(CollegeofLifeScienceHebeiUniversity,Baoding071002)

Abstract: Inthispaper,theimportanceofglycoproteinrearch,thetypesofglyco-peptidebonds,thetypesof

oligosaccharideschain,thegeneralmethodsofglycoproteinstructurerearch,andtheprogressofanalysismethodsin

thisfiledweresummarized.

Keywords: Glycoprotein Oligosaccharide Structureanalysis

1 糖蛋白的重要作用

糖蛋白(glycoprotein)是指由比較短,往往帶分

支的寡糖與多肽鏈某些特殊部位的羥基或酰氨基共

價連接而成的一類結合蛋白質。細胞中的糖蛋白有

可溶性的,也有與膜結合的不溶形式,生物體內大多

數蛋白質是糖蛋白[1]。糖蛋白中蛋白質是生理功

能的主要承擔者,糖鏈對蛋白質的功能起修飾作用,

即糖鏈影響蛋白質的整體構象,影響蛋白質的折疊、

溶解度、半衰期、抗原性及生物活性等,糖鏈與蛋白

質的相互作用介導細胞的專一性識別和調控各種生

命過程如:受精、發生、發育、分化、神經系統、免疫系

統恒態的維持等,在炎癥及自身免疫疾病、老化、癌

細胞異常增殖及轉移、病原體感染等過程中起重要

作用

[2,3] 。

糖鏈的合成并不是依據模板的復制過程,而是

包含了糖基的供體、糖基的受體、糖基轉移酶及糖苷

酶等因素在內的復雜過程,除受酶基因表達的調控

外,還受酶活性的影響,即便在同種分子的同一糖基

化位點上,糖鏈的結構也有差異,即糖鏈有微不均一

性,這種不均一性反映了組織、細胞類型、發育和分

化階段的不同,因此對糖鏈的結構及生物學作用只

能逐個的分別研究(cabyca)。糖鏈結構測定

和化學合成也遠比核酸和蛋白質要困難,各國科學

家都在致力于糖鏈結構分析和合成方法學上的突

破,為糖鏈的功能分析提供技術支持。繼功能基因

組學(functionalgenomics)和蛋白質組學(pro-

teomics)研究之后,糖組學(glycomics)正在成為全面

揭示生命本質所不可缺少的內容。

2 糖肽鍵類型

在糖蛋白的高級結構中,肽鏈折疊卷曲成特定

的空間結構,肽鏈上只有某些特殊的氨基酸序列位

點才能與糖鏈結合,糖鏈作為側鏈和親水基團暴露

在空間結構外面。

糖肽鍵是糖鏈和肽鏈的連接鍵,是指糖基異頭

碳原子上的羥基與肽鏈氨基酸殘基上的酰胺基或羥

基脫水形成的糖苷鍵。可分為N-糖苷鍵和O-糖苷

鍵兩大類。參與糖肽鍵的氨基酸殘基主要有:天冬

酰胺(Asn)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、羥賴氨酸

(Hyl)和羥脯氨酸(Hyp)。它們可以與N-乙酰葡萄

糖胺、N-乙酰半乳糖胺、木糖、半乳糖及阿拉伯糖形

基金項目:河北大學自然科學基金及河北省生物工程重點學科

作者簡介:武金霞,女(1966-),河北大學副教授,主要從事生物化學及分子生物學方向研究

生物技術通報

·技術與方法· BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2004年第1期

成5種主要的糖肽鍵,分別是:β-N-乙酰葡萄糖胺-天

冬酰胺(GlcNAc-Asn)、α-N-乙酰半乳糖胺-絲氨酸/

蘇氨酸(GalNAc-Ser/Thr)、β-木糖-絲氨酸(Xyl-Ser)、

β-半乳糖-羥賴氨酸(Gal-Hyl)、α-L-阿拉伯糖-羥脯氨

酸(Ara-Hyp)。此外,還發現罕見的以N-末端氨基

酸殘基為連接點的糖肽鍵,存在于小鼠血紅蛋白

A1c中。

2.1 N-糖苷鍵[4]

2.1.1 組成

N-糖苷鍵以β-N-乙酰萄葡糖胺-天冬酰胺為連

接點。在糖蛋白中僅有N-乙酰-β-D-葡萄糖胺殘基

與天冬酰胺相連,生成的鍵是4-N-(2-乙酰氨基-2-脫

氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-L-天冬酰胺。

2.1.2 糖苷鍵附近的氨基酸順序

N-糖苷鍵不僅與氨基酸種類有關,而且與氨基

酸順序有關。帶糖鏈的天冬酰胺殘基附近往往含有

一個蘇氨酸或絲氨酸殘基,即它具有順序子結構,稱

為天冬酰胺順序子:天冬酰胺-X-蘇氨酸(Asn-X-

Thr)或天冬酰胺-X-絲氨酸(Asn-X-Ser),其中X可

代表除脯氨酸以外的任何一種氨基酸殘基。表明糖

蛋白中能與天冬酰胺殘基相連的寡糖鏈數目是有限

的,并非所有天冬酰胺順序中的天冬酰胺都發生糖

基化,如雞卵清蛋白。天冬酰胺順序子不僅與糖基

化有關,可能對糖鏈的組成與長短也有控制作用,如

順序子中的X為極性氨基酸時,常生成復雜型寡糖

鏈;X為非極性氨基酸時常形成單純型寡糖鏈。

2.2 O-糖苷鍵[5]

主要有4種類型:

(1)以α-N-乙酰半乳糖胺-絲氨酸/蘇氨酸殘基

為起點,此糖肽鍵是3-O-(2-乙酰胺-2-脫氧-α-D-吡喃

半乳糖基)-L-絲氨酸或(蘇氨酸)。是粘液糖蛋白的

特征鍵,在某些非粘液型糖蛋白中也有發現。

(2)以木糖-絲氨酸殘基為連接點,大多數以木

糖殘基與肽鏈上絲氨酸殘基結合,形成O-糖苷鍵而

連接起來。

(3)以半乳糖-羥賴氨酸殘基為連接點,此糖肽

鍵稱為5-O-β-吡喃半乳糖基-5羥基-L-賴氨酸。是膠

原和一些膠原樣多聚物的特征結構。在發生糖基化

的羥賴氨酸(Hyl)之后,緊接著往往是一個甘氨酸

(Gly)。

(4)以阿拉伯糖-羥脯氨酸殘基為連接點,此糖

肽鍵稱為4-O-β-D-吡喃阿拉伯糖基-4-羥-反式-L-脯

氨酸,目前僅在高等植物中發現,主要存在于綠色植

物和綠藻細胞壁的糖蛋白中。

3 糖鏈結構

糖蛋白的糖鏈可以是直鏈或支鏈,糖基數一般1

～15個左右。不同的糖蛋白分子中,其糖鏈數目不

等,多肽鏈上糖鏈的分布亦不均勻,如膜糖蛋白的糖

鏈全部分布在暴露于膜外側的肽鏈上,而不存在于

膜的內部。理論上講,糖蛋白上的糖鏈有無數種結

構模式,但生物體內可能有某種限制因素,使實際存

在的糖鏈類型大減。迄今發現,許多不同種類的糖

蛋白含有共同的核心結構。

3.1 N-連接的糖鏈[4]

N-糖鏈通常包含一個五糖核心結構,稱為三甘

露五糖核心結構,該核心由內側的兩個GlcNAc和外

側的三個甘露糖(Man)構成,其中兩個α-Man,分別

以α1※3和α1※6與內側的β-Man相連,各種生物

體內N-連接的糖蛋白糖鏈中均含有此結構。根據

五糖核心結構連接其它糖的情況,N-糖鏈分為以下

幾類:

(1)高甘露糖型 寡糖鏈只含有甘露糖和N-乙

酰氨基葡萄糖,而且只有甘露糖連接在五糖核心區

上,如卵白蛋白。

(2)復雜型 寡糖鏈除含有甘露糖和N-乙酰氨

基葡萄糖外,在甘露糖上還連接有半乳糖、巖藻糖和

唾液酸等。α1※3Man的C

2

和C

4

位,以及α1※6Man

的C

2

和C

6

位上連接外側糖連,即天線,可分為二天

線型(C2C2)、三天線型(C2,4C6)和四天線型

(C

2

,

4

C

2

,

6

)。只有極少數是單天線型的,五天線型僅

發現于鳥類卵清中。

(3)雜合型 又稱混合型,既有高甘露糖鏈,又

有N-乙酰氨基半乳糖鏈,連接于五糖核心的兩個α-

Man上,如卵清蛋白。

(4)核心巖藻糖型 五糖核心的最內側GlcNAc

上以α1※6連接巖藻糖(Fuc)。

(5)平分型β-Man上連接一個GlcNAc。

3.2 O-連接的糖鏈[4]

O-連接的糖鏈存在多種形式,如GalNAc-Ser/

Thr,GlcNAc-Ser/Thr,Gal-Ser,Ara-Ser/Thr,Man-

32

生物技術通報Biotechnology Bulletin 2004年第1期

Ser/Thr等。這類糖類結構共同點,是由一種或少數

幾種單糖與某些含羥基氨基酸連接,不存在共有的

核心結構,但在O-GalNAc連接的糖鏈中已發現有4

類核心結構。其中研究得最多的是粘蛋白、血漿蛋

白和膜蛋白。

4 糖鏈分析策略

4.1 糖蛋白及糖鏈結構的定性鑒定

樣品經聚丙烯酰胺凝膠電泳后用Shiff試劑、甲

苯胺藍、硫酸-百里苯酚等染色可以定性鑒定糖蛋

白[6～8],也可以電泳后進行Western印跡,將蛋白條

帶轉移至硝酸纖維素膜上,再以糖蛋白測定試劑盒,

進行糖蛋白定性試驗[9]。

凝集素是一類能識別、結合特異單糖或糖鏈結

構的糖蛋白,糖結合專一性不同的凝集素,可以區別

糖殘基的連接方式、分支和修飾情況,因此凝集素不

僅能用于寡糖和糖復合物的分離純化,還能用于糖

鏈結構分析。常用凝集素親和層析、親和沉淀、親和

電泳、酶聯免疫(ELISA)、印跡等方法鑒定分離糖

鏈、糖肽及鑒定糖鏈結構[10]。

4.2 糖蛋白及糖肽的制備

糖蛋白的分離制備常采用離子交換層析、凝膠

過濾、凝集素親和層析等方法;糖肽的制備首先要用

蛋白酶切斷蛋白主鏈,糖蛋白的酶解,酶的用量比純

蛋白的酶解要多幾倍,時間也更長。糖肽片段的分

離一般采用各種層析方法。

4.3 從糖肽片段上切下糖鏈

4.3.1 酶法[11]

常用的酶有glycopeptidaA、N-peptideglycosi-

daF、內切β-N-乙酰半乳糖胺酶、內切β-N-乙酰葡

萄糖胺酶、內切α-N-乙酰半乳糖胺酶、內切β-半乳糖

苷酶。酶切法具有高效、專一、條件溫和等特點,但

酶價格昂貴,如果所用的酶是糖蛋白,那么酶本身造

成的糖鏈污染也是必須考慮的問題。

4.3.2 化學法[5]

β-消除反應廣泛應用于含N-乙酰半乳糖-絲氨

酸/蘇氨酸(Gal-NAcSer/Thr)連接的糖蛋白或糖肽;

肼解法用于含N-乙酰氨基葡萄糖(Glc-NAcAsn)連

接的糖蛋白或糖肽。為了避免肼對糖鏈的水解及脫

乙酰作用,肼解后需對糖鏈進行還原及乙酰化;三氟

乙酸酸解法主要用于Glc-NAcAsn連接的糖肽或糖

蛋白。較溫和的三氟乙酸水解條件可避免還原端與

次末端的己糖胺殘基受到破壞。

4.4 寡糖鏈的分離純化

常采用紙層析、薄板層析、SephadexG-25、

SephadexG-50層析分離蛋白與寡糖鏈,但葡聚糖凝

膠上脫落的可溶性葡聚糖片段會造成污染,因此用

聚丙烯酰胺凝膠Bio-Gel分離。所有未知糖鏈的純

化,均需要HPLC來完成,固定化凝集素可以用來純

化具有特異結構的寡糖。

4.5 糖鏈的結構分析

要闡明一種寡糖鏈結構,必須了解以下內容:分

子量、單糖殘基組成、單糖殘基間的順序、環狀結構

的類型、糖苷鍵的構型、α-,β-異頭異構體、羥基被取

代情況等。

糖的組分復雜,結構相似,沒有顯色基團,如果

不經衍生難以進行光譜、色譜分析,因此糖鏈結構分

析難度較大。傳統的方法有凝膠過濾法、蒸氣壓法

(測定分子量);部分酸水解、完全酸水解、紙色譜、氣

相色譜法(測定單糖殘基組成);選擇性酸水解、糖苷

酶順序水解、凝集素親和層析(單糖殘基間的順序);

紅外光譜(環狀結構的類型);單糖與氨基酸組成分

析、稀堿水解、肼解反應(糖苷鍵的構型);糖苷酶水

解、核磁共振、紅外光譜(α-,β-異頭異構體);甲基化

反應-氣相色譜、過碘酸氧化(羥基被取代情況)。

前幾十年質譜就應用于糖類化合物的分

析[12,13],應用GC-MS可了解單糖組成及大致的分

枝情況[14]。快原子轟擊電離質譜(FAB-MS)和液態

二次離子質譜(LSI-MS)[15,16]可以測定nmol樣品/

μl基質的寡糖,并可獲到分子量信息和結構信息。

將分離技術與質譜法相結合是分離科學方法中的一

項突破性進展,LC-MS可以同時檢測糖肽的位置并

且提供結構信息。毛細管電泳(CE)與質譜的聯用技

術[17],在一次分析中可同時得到遷移時間、分子量

和碎片信息,是LC-MS的補充。大氣壓電噴霧

(ESI)質譜系統的建立,即使只有pmol量級且未經

衍生的大分子寡糖樣品,也可以使用ESI分

析[18,19]。基體輔助激光解吸-電離質譜(MALDI-

MS)[20～22]

可以精確地測定ng量級的葡聚糖(糊

精),相對分子質量達7000u.,能快速(數分鐘1個

樣品)、準確(可達幾千分之幾)、高靈敏度(nmol量

332004年第1期 武金霞等:糖蛋白的結構、功能及分析方法

級)測定大分子多糖相對分子質量,該技術的靈敏度

由于引進Q-TOF(QuadTimeFlight)而大幅度提高,

可分析飛摩爾(10～15mole)級的樣品以提供糖蛋白

糖基化位點和糖鏈序列信息,這些技術與外切糖苷

酶、熒光標記衍生物、HPLC/CE和NMR技術的聯

合使用,可測定出糖鏈的組成和連接方式。

5 糖鏈在糖蛋白中的作用

獲得糖鏈的精確結構信息是研究糖基化對蛋白

質功能影響的基礎。克隆蛋白質基因,采用定點突

變技術使蛋白質的糖基化位點發生改變,再將突變

基因轉化具有糖基化修飾的受體菌,或者將完整的

蛋白質基因轉化糖基化修飾缺陷型的受體菌,比較

分析表達產物與天然產物的生化性質和生物學活性

的變化;選擇不同酶切位點的糖苷酶水解糖鏈,也可

以分析失去糖鏈的蛋白部分的性質變化。

6 糖生物學研究的限制因素及趨勢

目前糖生物學研究中要解決的關鍵技術問題是

糖鏈結構分析和合成方法的建立。在糖鏈的分析上

需要建立高分辨率、快速的序列測定方法和構象研

究的方法、模型;在合成上需要建立高效的合成方

法。但糖鏈的結構分析和合成很難象核酸和蛋白質

那樣完全靠化學方法解決,因此化學法和酶法相結

合是發展趨勢。在功能研究方面,主要是研究糖鏈

合成代謝途徑和糖鏈在細胞內、細胞間的功能,其前

沿領域為糖基化、細胞粘附分子(即識別糖鏈信息分

子的蛋白質)與糖鏈的相互作用及糖在微生物感染

中的作用3個領域。

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