硝酸還原酶

廣西植物Guihaia 24

(

4

)

:367-372 2004年7月

硝酸還原酶活性的調(diào)節(jié)及可能機制的研究進展

張 濤1,陳 云2,謝 虹2,梁建生23

(

1.揚州大學農(nóng)學院,江蘇揚州225009;2.揚州大學生物科學與技術學院,江蘇揚州225009

)

摘 要:氮素是農(nóng)業(yè)研究的重點,硝酸還原酶是氮代謝中的一個關鍵酶。有關硝酸還原酶的研究一直是植物

生理生化研究的重點。該文就近年來有關硝酸還原酶活性調(diào)節(jié)的可能機制的研究進展作了簡要的綜述。

關鍵詞:硝酸還原酶;蛋白激酶;磷酸酯酶;142323蛋白

中圖分類號:Q945 文獻標識碼:A 文章編號:100023142

(

2004

)

收稿日期:2003203224 修訂日期:2003209224

作者簡介:張濤(

19792)

,男,山東威海人,碩士研究生、植物學專業(yè)。3為通訊作者

Therearchprogressoftheregulationofnitrate

reductaactivityandthepossiblemechanism

ZHANGTao1,CHENYun2,XIEHong2,

LIANGJian2sheng23

(

11CollegeofAgriculture,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China;21CollegeofBiological

ScienceandTechnolog,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China

)

Abstract:dyofnitratereducta,whichisakeyenzyme

inthemetabolismofnitrogen,ticlesummarizestherearchprogressofthe

regulationofnitratereductaactivityandthepossiblemechanisminrecentyears.

Keywords:nitratereducta;proteinkina;phosphorylation;142323protein

硝酸還原酶(

nitratereducta,NR,EC.1.6.6.

1/2

)是氮代謝過程中的一個重要的調(diào)節(jié)酶和限速

酶。在植物的根和葉中都有該酶的存在,它是一種

可溶性的鉬黃素蛋白,由黃素腺嘌呤二核苷酸

(

FAD

)、細胞色素b

557

和鉬等輔助因子組成。研究

表明,NR催化的反應不是唯一的,它能夠催化2個

電子從NAD

(

P

)

H+H+至NO

3

-,使后者轉(zhuǎn)變?yōu)?/p>

NO

2

-;還可以催化一個電子從NAD

(

P

)

H+H+至

NO

2

-生成NO

(

Yamasaki等,1999

)

;還有報道NR

能催化1個電子從NAD

(

P

)

H+H+至O

2

生成超氧

自由基(圖1

)(

Barber和Kay,1996;Yamasaki和

Sakihama,2000

)。

在正常情況下,還原NO

3

-為NO

2

-的反應是硝

酸還原酶催化反應的主流,反應在細胞質(zhì)中進行。

NR催化NO

2

-生成NO的反應只占催化NO

3

-還

原能力的很小百分比(約1%

)

,盡管產(chǎn)生NO的量

很少,但其對植物的一些生理活動有著重要的調(diào)節(jié)

及影響,RadhikaDesilan等發(fā)現(xiàn),NR催化NO

2

-產(chǎn)

生的NO在ABA誘導氣孔關閉的過程中有重要的

作用,通過對ABA鈍感型等突變體的研究發(fā)現(xiàn),NR

催化的NO的生成是ABA誘導氣孔關閉所需的。

但是NO在其他生理活動中的作用機理尚不清楚

(

Kair和Huber,2001

)。

1 硝酸還原酶的組成

研究發(fā)現(xiàn),高等植物的NR似乎是由相同亞基

組成的二聚體,每個亞基含有3個輔助因子,即

FAD、血紅素(細胞色素b

557

)和鉬輔因子(

MoCo

)。

每個輔因子相當于一個氧化還原中心。MoCo是一

個取代的喋呤基(又稱鉬喋呤)

,含有由兩個硫配體

結(jié)合的鉬。用限制性內(nèi)切酶對菠菜NR進行酶切,

發(fā)現(xiàn)二聚體結(jié)構的分子具有75KDa含鉬的區(qū)域,

血紅素輔基與14KDa區(qū)域相聯(lián)系,而FAD輔基包

含在28KDa的區(qū)域,3個區(qū)域似乎通過鉸鏈區(qū)域

(

hinge

regions

)連接。通過對高等植物NR的克隆

和序列分析得知:MoCo結(jié)合區(qū)域位于蛋白質(zhì)N2末

端,血紅素結(jié)合區(qū)域位于蛋白質(zhì)的中心區(qū)域,FAD

結(jié)合區(qū)域位于蛋白質(zhì)的C2末端。后來得知,NR分

子中電子的傳遞途徑是NAD

(

P

)

H+H+→FAD→

細胞色素b

557

→鉬喋呤→硝酸鹽(宋松泉等,1993;

Ahmad和Abdin,1999

)。

在大多數(shù)高等植物中,NR以NADH為電子供

體,這種NR對NO

3

-有相對低的Km值。而在水

稻幼苗、大豆等植物中,NR可以從NADH+H+或

NADPH+H+得到電子,并且以NADPH+H+為電

子供體時活性較高。Ahmad等(

1999

)發(fā)現(xiàn)芥菜幼

苗期,當營養(yǎng)液中的NO

3

-濃度較低時,以NADH

為電子供體的NR催化占主導,隨著NO

3

-濃度的

升高,以NADPH為電子供體的NR催化占據(jù)了主

導作用。

2 硝酸還原酶活性調(diào)節(jié)機制

2.1硝酸還原酶的活性狀態(tài)

NR對環(huán)境條件十分敏感,光、NO

3

-含量、CO

2

濃度等均會影響其活性。例如菠菜由光下移至暗中

幾分鐘后,其葉片NR便明顯地失活,而NR蛋白的

合成或降解無法在如此短時間內(nèi)達到這樣的結(jié)果

(

Kair和Forster,1989

)。可以設想,植物體內(nèi)存在

一種機制,能快速準確地調(diào)控NR的活性以適應環(huán)

境條件的改變。這種改變可能只是NR蛋白自身的

改變,并沒有涉及到轉(zhuǎn)錄或翻譯水平。用凝膠柱層

析的方法除去粗酶液中的小分子化合物后,NR仍

可以保持相當?shù)幕钚?這說明該酶不是變構調(diào)節(jié)

(

allostericmodulation

)

,其活性的改變是由于NR蛋

白的修飾而實現(xiàn)的,由此推測最有可能的機制是蛋

白的氧化/還原或蛋白的磷酸化/去磷酸化,由于還

原劑二硫蘇糖醇(

DTT

)或氧化劑過氧化氫對NR的

活性影響不大(

Kair和Huber,1994

)

,因而得知

NR活性的調(diào)節(jié)不是由蛋白的氧化/還原引起的。

通過32P標記技術,發(fā)現(xiàn)菠菜NR蛋白在Ser

543

可以

被磷酸化,并引起NR的失活。后來又發(fā)現(xiàn),磷酸化

不是NR失活唯一的原因,它還需要額外的蛋白的

參與(

Kair和Huber,2001

)

,這類蛋白即142323蛋

白家族。在有毫摩爾每升濃度級的游離Mg2+存在

的情況下,142323蛋白(

142323s

)與NR的磷酸化位

點結(jié)合,從而導致NR失活(

Aitken,1996;Moorhead

等,1999

)。所以推測細胞中NR可能存在3種狀

態(tài):①自由的NR

(具有酶活性)

;②被磷酸化的NR

(

pNR,具有酶活性)

;③142323s結(jié)合的磷酸化NR

(

pNR:142323s,無酶活性)(

Kair等,2002

)。以上

三種狀態(tài)的NR的比率是可變的,且主要是由環(huán)境

因素決定的,當外界條件例如光、NO

3

-、CO

2

等發(fā)生

改變時,三種NR活性狀態(tài)的比率會發(fā)生可逆而迅

速的變化,現(xiàn)在認為這是暗處理一段時間后,菠菜葉

片中NR快速地失活的主要原因。

2.1.1142323蛋白家族 142323s是起廣泛調(diào)節(jié)作用

的一類蛋白。最先發(fā)現(xiàn)142323s是存在于動物中的

含量豐富、酸性的、可溶性的腦蛋白,其分子量為25

～32kDa。但隨著植物領域的進一步研究,發(fā)現(xiàn)在

所有的已研究的真核生物器官中均有142323s家族

成員的存在,Ronquist等列出在48個品種中有

153種該類蛋白。142323s有著高度的序列一致性,

即使在不同的品種內(nèi),它也可以對靶蛋白起作用。

142323s一般是通過與目標蛋白結(jié)合而起作用的,目

標蛋白通常會有磷酸化位點,142323s可以識別該位

863

廣 西 植 物 24卷

點,結(jié)合后起到調(diào)節(jié)的作用。Muslin等發(fā)現(xiàn)142323s

識別的位點通常有RSXpSXP序列(

X表示任意一

種氨基酸,pS表示磷酸化的Ser。)(

Muslin等,

1996

)

,當然142323s還可以與其他的磷酸化片斷或

非磷酸化片斷結(jié)合(

Masters等,1999

)。

在高等植物中,142323s可以調(diào)節(jié)眾多的生物代

謝過程,甚至在擬南芥中,由于142323s的這種廣泛

調(diào)節(jié)作用,又稱之為廣泛調(diào)節(jié)因子(

GRFs

)(

Rooney

和Ferl,1995

)。142323s能夠調(diào)節(jié)蛋白激酶C的活

化(

Toker等,1990

)

,通過植物質(zhì)膜H+2ATP酶調(diào)節(jié)

質(zhì)子泵(

Oecking等,1994

)

,調(diào)節(jié)植物代謝過程中的

關鍵酶(

Bachmann等,1996;Toror等,1998

)

,如在

氮代謝過程中,它可以改變NR和谷氨酰胺合成酶

等的活性狀態(tài)。

2.2硝酸還原酶活性狀態(tài)轉(zhuǎn)換的可能機制

有研究表明,NR可以在MoCo區(qū)域與血紅素

區(qū)域之間的鉸鏈區(qū)域被磷酸化,從而產(chǎn)生了一個可

與142323s結(jié)合的位點(

Bachmann等,1996

)。當有

毫摩爾每升濃度級的游離Mg2+存在時,142323s結(jié)

合到pNR上,使之失去活性。當沒有Mg2+存在時

(加入EDTA

)

,所有的NR處于活性狀態(tài)(

100%

)

,

當存在Mg2+時,NR活性為實際活性狀態(tài)(

x%

)。

NR活性狀態(tài)的轉(zhuǎn)換可以表示為圖2

(

Kair和Hu2

ber,2001

)。

2.2.1硝酸還原酶的磷酸化與去磷酸化 用陰離子

交換色譜分析菠菜的葉片提取液,可以測得數(shù)個

NR激酶(

PK

)峰,這些激酶可以磷酸化NR的Ser

543

位,并產(chǎn)生142323s結(jié)合位點。一種激酶是SNF1相

關酶(

SnRK1

)(

Subden等,1999

)

,這種酶本身可能

被代謝物抑制。另外兩種激酶屬于CDPKs

(

Calci2

um2dependentproteinkinas

)。現(xiàn)在還不清楚

SNF1相關酶或CDPKs是如何磷酸化NR或如何通

過其它信號調(diào)控NR的,但暗中葉片細胞內(nèi)Ca2+濃

度伴隨NR磷酸化、失活的同時而升高的現(xiàn)象可能

提供一條研究線索(

Miller和Sanders,1987

)。

pNR的去磷酸化是由磷酸酯酶2A催化的

(

PP2A

)

,它主要存在于胞漿內(nèi),但現(xiàn)在對植物中該

酶的結(jié)構及組成所知不多,僅知道其作用于pNR的

活性也受代謝物的調(diào)節(jié)。另有研究發(fā)現(xiàn),去磷酸化

并非活化NR的唯一途徑(

Mackintosh和Meek,

2001

)

,一些小分子,包括磷酸鹽、EDTA和AMP也

能活化NR

(

Aguera等,1999;Kair等,1992

)。而

圖2 NR的活性狀態(tài)及參與分子

Fig.2 NRactivitystateandtherelevantmolecules

PK催化NR的磷酸化,PP催化NR的去磷酸化。NR的

磷酸化狀態(tài)并不失去活性,但由于NR的磷酸化,

使得142323s能夠在Mg2+存在的條件下與

pNR結(jié)合,最終導致NR的失活。

NRcanbephosphorylatedbyPKanddephosphorylated

eexistenceofMg2+,142323scan

stateofpNR:142323shasnoactivation.

142323s與pNR結(jié)合后會阻礙pNR的去磷酸化,因

為142323s結(jié)合后的pNR的去磷酸化比pNR的去

磷酸化速度更緩慢(

Bachmann等,1996

)。Bach2

mann等人認為142323s使NR的去磷酸化減緩的原

因是使NO

3

2

的還原減慢,從而光合作用能夠提供

NH

4

+轉(zhuǎn)化為氨基酸所需足夠的碳骨架。還有人認

為142323s與NR結(jié)合后會穩(wěn)定NR的磷酸化狀態(tài),

阻止去磷酸化。

蛋白激酶的作用與其底物ATP水平有關,缺氧

條件下,組織中ATP水平下降,NR被活化,這可能

963

4期 張 濤等:硝酸還原酶活性的調(diào)節(jié)及可能機制的研究進展

是NR磷酸酯酶的作用超過NR激酶的作用(

Glaab

和Kair,1993

)。總之,在一般情況下,蛋白激酶和

磷酸酯酶的共同作用使得NR和pNR處于動態(tài)的

平衡,該平衡會被外界因素快速地調(diào)節(jié)。

2.2.2142323蛋白與硝酸還原酶的結(jié)合 現(xiàn)在我們

已經(jīng)清楚142323s在植物及真菌等生物體中起重要

的調(diào)節(jié)作用(

Aitken,1996

)。天然存在的NR分子

與142323s結(jié)合的位點是在第一鉸鏈區(qū)域可被磷酸

化的Ser

543

附近的序列(

Bachmann等,1996

)。14232

3s與pNR結(jié)合后引起NR失活的原因可能是使

NR的空間結(jié)構發(fā)生改變,進而導致MoCo區(qū)域與

血紅素區(qū)域間的電子傳遞無法進行(

Kair和Hu2

ber,2001

)。Weiner和Kair

(

1999

)利用突變體的

研究發(fā)現(xiàn),每個NR分子可以與2個142323s結(jié)合,

于是推測NR分子上可能存在另外一個142323s結(jié)

合位點(

Pigaglio等,1999;Weiner和Kair,2001

)

,

142323s與該位點結(jié)合的作用可能是穩(wěn)定NR的磷

酸化狀態(tài),另外還有研究證明除了Ser

543

位點,NR

的N末端也參與了142323s的結(jié)合。

當有二價陽離子存在時,142323s與磷酸化片段

的連接會得到促進(

Athwal等,1998

)。Provan等發(fā)

現(xiàn),要想分離出142323s結(jié)合的煙草pNR,必須要有

游離Mg2+的存在(

Sugden等,1999

)

,這進一步證實

了只有毫摩爾每升濃度級的游離Mg2+時,142323s

才會與pNR結(jié)合并使之失活的說法。在光/暗轉(zhuǎn)換

的條件下,Mg2+的存在會明顯改變NR活性。

Kair等(

2001

)推測金屬陽離子在NR活性調(diào)節(jié)中

可能起以下幾個作用:

(

1

)蛋白激酶本身是一個Ca

離子依賴酶;

(

2

)蛋白激酶的底物是Mg2+2ATP;

(

3

)

金屬陽離子是使pNR2142323s復合體失活所必需

的。但至今仍不清楚金屬陽離子是在142323s與

pNR結(jié)合中所必需的,還是pNR2142323s復合體失

活中所需的,或者起到以上二者作用(

Weiner和

Kair,1999

)。

由上文所述,NR的三種活性狀態(tài)中只有14232

3s結(jié)合pNR態(tài)無活性,所以142323s的結(jié)合與否很

重要。有試驗證明,營養(yǎng)條件、激素均可能對14232

3s進行翻譯后調(diào)節(jié),從而改變142323s與pNR的結(jié)

合比例,進一步調(diào)節(jié)NR的活性(

Mackintosh和

Meek,2001

)。另外,142323s是一類起廣泛調(diào)節(jié)作

用的蛋白家族,pNR不是它們的唯一受體,細胞內(nèi)

142323s含量遠高過NR的量,二者要想結(jié)合,pNR

必須要和可與142323s結(jié)合的磷酸化片段競爭,該競

爭也在NR的活化/去活化過程中起一定的調(diào)節(jié)作

用(

Camoni等,1998

)。

在NR參與磷酸化失活的位點的研究中,早先

發(fā)現(xiàn)馬鈴薯NR的N2末端參與了該酶磷酸化失活

的過程。Pigaglio等(

1999

)發(fā)現(xiàn)NR蛋白的N2末端

氨基酸去除后,較野生型對熱更為敏感,但是相應的

對黑暗條件下的磷酸化去活不敏感,而且缺失N2末

端的突變體不會受光/暗交叉處理的影響。在菠菜

中,當?shù)鞍踪|(zhì)水解NR使之失去前45個氨基酸時,

NR活性不再因142323s的結(jié)合而失活盡管它仍會

被磷酸化。這表明,NR的N2末端區(qū)域在一定程度

上參與其磷酸化失活的過程。Provan等的研究結(jié)

果與Pigaglio有所不同,在有Mg2+和磷酸酯酶抑制

劑存在的條件下,NR與內(nèi)生142323s通過層析可以

共分離。NR活性的測定與蛋白質(zhì)雜交表明內(nèi)生

142323s可以與野生型NR和突變體NR共同分離。

突變體NR的電子傳遞在亞鐵血紅素結(jié)合區(qū)域被

Mg2+/142323s抑制,而在野生型NR中不存在這種

現(xiàn)象,這可能是142323s與野生型NR和突變體NR

的結(jié)合形式不同。而且認為NR的不穩(wěn)定性與鉬喋

呤所在的部位有關,N末端的56位氨基酸可能與鉬

喋呤的穩(wěn)定性有關(

Bachmann等,1996

)。

2.3蓖麻Ricinuscommunis中硝酸還原酶活性調(diào)節(jié)

就現(xiàn)研究的高等植物中,絕大部分NR活性的

調(diào)節(jié)是通過NR、磷酸化NR、142323s結(jié)合的磷酸化

NR三者之間的轉(zhuǎn)換而實現(xiàn)的,但也有例外,Ricinus

communis的葉片和根中的NR活性調(diào)節(jié)機制就與

其它高等植物不同。據(jù)Kandlbinder等(

2000

)的研

究,在pH7.6且有5～10mMMg2+存在的條件下,

Ricinus的NR活性極低,光下與暗中的差別也不

大,但在EDTA存在的條件下,最大NR活性是正

常的。但當調(diào)節(jié)pH低于7時,提取液中NR活性

快速提高,調(diào)節(jié)pH大于7.3時,NR活性又變得極

低。其原因可能是在不同pH值條件下,NR對

Mg2+的敏感度相差很大,在生理pH值下,Ricinus

對Mg2+較其它高等植物更敏感。

用免疫研究技術進一步研究蓖麻NR活性調(diào)節(jié)

的機制,發(fā)現(xiàn)其NR的Ser磷酸化位點和142323s結(jié)

合修飾是與其它植物相同的,所以關于RicinusNR

活性的調(diào)節(jié)機制仍然沒有明確的答案。只是推測

NR分子上存在重金屬離子結(jié)合位點,金屬離子如

Zn2+的結(jié)合會引起NR的失活(

Campbell,1999

)

,該

結(jié)合位點的序列可能會發(fā)生改變,使得Mg2+亦可

073

廣 西 植 物 24卷

與之結(jié)合,pH值的改變可能引起NR重金屬結(jié)合位

點序列發(fā)生改變,使得NR對Mg2+的敏感性提高,

從而調(diào)節(jié)酶的活化/失活。

3 硝酸還原酶的降解

NR的半衰期很短,僅為幾小時,所以細胞內(nèi)

NR的含量不僅決定于NR的合成速率,還決定于

NR的降解速率。光下NR的合成高于暗中,35S標

記的NR在暗中的降解速率快于在光下(

Weiner和

Kair,1999

)。Kair和Huber通過蛋白質(zhì)雜交技

術發(fā)現(xiàn),黑暗處理菠菜時,去磷酸化會減緩其葉片中

NR的降解。他們還發(fā)現(xiàn),NR蛋白磷酸化酶不僅控

制NR的催化活性,而且是NR降解過程中的信號,

磷酸化的NR更易被降解。后來,有人用人工手段

使黑暗處理中的葉片NR恢復活性后,發(fā)現(xiàn)NR蛋

白量處于較穩(wěn)定的狀態(tài),這表明非活性態(tài)的NR比

有活性的NR更容易被降解(

Kair等,1999

)。由

此可以推測NR降解的一個重要前提是142323s與

pNR的結(jié)合。Weiner等推測,142323s在NR的降

解過程中起到以下三點作用:

(

1

)促進NR的失活;

(

2

)阻止pNR的分裂;

(

3

)引發(fā)NR的蛋白水解。

Cotelle等(

2000

)卻發(fā)現(xiàn)在缺少糖的情況下,

Arabidopsis的細胞內(nèi)NR及其它蛋白失去了14232

3s的結(jié)合位點,如果按上述觀點,則NR實際活性會

增強,但事實與之相反,NR快速地被降解。于是推

測可能存在另一種完全不同的蛋白酶,它由于糖缺

乏而產(chǎn)生,其作用底物是未結(jié)合142323s的NR。而

在糖充分的條件下,并無上述情況發(fā)生。至今仍不

清楚細胞內(nèi)高糖含量、高NR活性狀態(tài)、高NR穩(wěn)定

性之間是相互關聯(lián)還是有因果關系。

4 結(jié)語

關于NR活性調(diào)節(jié)的研究已由過去的生理水平

逐步深入到分子水平。隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)

NR能催化數(shù)種反應。它催化NO

2

-生成的NO在

植物體內(nèi)可能起一定的信號作用,但此反應受哪些

內(nèi)外條件的調(diào)節(jié),生成的NO在植物體內(nèi)又如何起

作用,其作用是在特定條件下產(chǎn)生還是一直有產(chǎn)生,

這些將是今后研究的一個重點。另外,盡管對NR

的翻譯后調(diào)節(jié)已經(jīng)有一定程度的了解,但仍有許多

問題要解決:影響NR活性的因素是否能夠調(diào)節(jié)

NR降解酶、是否與NR的降解有直接關系,NR降

解過程中是否還有其他一些物質(zhì)起作用。影響NR

活性的因素中,光是如何起作用的,其作用是直接的

還是間接的,與糖含量有無關聯(lián)。我們發(fā)現(xiàn)干旱、氮

素濃度的高低對NR活性有著很大的影響(待發(fā))

,

這種影響是直接的還是間接的還有待進一步研究。

在NR翻譯后調(diào)節(jié)過程中,142323s本身的調(diào)節(jié)機制

與其和pNR的結(jié)合有何聯(lián)系,pNR和其他磷酸化

片段與142323s結(jié)合的競爭機制如何。重金屬離子

在NR活性調(diào)節(jié)過程中起何種作用等等。雖然仍有

很多問題需要解決,但隨著多種突變體的得到,分子

生物學技術及免疫技術的深入應用,又將使NR的

研究進入一個全新的領域。

參考文獻:

宋松泉,王永銳,傅家瑞.1993.高等植物中硝酸還原酶的

研究進展[J].作物雜志,

(

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廣 西 植 物 24卷