二型肺泡上皮細胞

維甲酸拮抗丙烯醛損傷肺泡Ⅱ型上皮細胞的作用

程航遠;張強弩;朱艷芳;王晨昱;王勇;劉沨;焦宗憲

【摘要】背景：肺泡Ⅱ型上皮細胞是肺泡上皮組織的干細胞，它的損傷和多種肺

部疾病密切相關。有研究顯示維甲酸不僅能促進發育期大鼠肺泡的形成，還能促進

肺損傷后的修復，但也有研究表明維甲酸在肺氣腫模型的治療中無明顯作用。目的：

探索維甲酸能否拮抗丙烯醛對原代培養大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的損傷作用。方法：

綜合Dobbs等的細胞分離方法并加以改良，從普通雄性SD大鼠肺組織中成功分

離出較高純度的肺泡Ⅱ型上皮細胞，并行原代培養。應用MTT法檢測丙烯醛對肺

泡Ⅱ型上皮細胞活性的影響，流式細胞術檢測在丙烯醛及維甲酸作用下肺泡Ⅱ型上

皮細胞的細胞周期變化。結果與結論：MTT檢測結果顯示丙烯醛作用下大鼠肺泡

Ⅱ型上皮細胞生長明顯受抑，而且肺泡Ⅱ型上皮細胞活性與藥物濃度成劑量效應關

系。流式細胞儀檢測結果顯示丙烯醛作用下G1期細胞增加，維甲酸對丙烯醛的拮

抗作用不明顯。提示丙烯醛對原代培養的肺泡Ⅱ型上皮細胞具有明顯的損傷作用，

但維甲酸對丙烯醛的拮抗作用不明顯，其作用機制還需進一步深入研

究。%10.3969/.2095-4344.2012.50.023

【期刊名稱】《中國組織工程研究》

【年(卷),期】2012(000)050

【總頁數】6頁(P9437-9442)

【關鍵詞】原代培養;肺泡Ⅱ型上皮細胞;分離;純化;丙烯醛;維甲酸;肺損傷;流式細胞

術;細胞活性;細胞周期

【作者】程航遠;張強弩;朱艷芳;王晨昱;王勇;劉沨;焦宗憲

【作者單位】蘭州大學基礎醫學院病理學研究所,甘肅省蘭州市730000;蘭州大學

基礎醫學院病理學研究所,甘肅省蘭土耳其旅 州市730000;蘭州大學基礎醫學院病理學研究

所,甘肅省蘭州市730000;蘭州大學基礎醫學院病理學研究所,甘肅省蘭州市

730000;蘭州大學基礎醫學院病理學研究所,甘肅省蘭州市730000;蘭州大學基礎

醫學院病理學研究所,甘肅省蘭州市730000;蘭州大學基礎醫學院病理學研究所,甘

肅省蘭州市730000

【正文語種】中文

【中圖分類】R318

0引言

肺泡上皮由肺泡Ⅰ型上皮細胞和肺泡Ⅱ型上皮細胞構成，其比例約為1∶2，這兩

類細胞在功能上和形態上明顯不同。肺泡Ⅱ型上皮細胞在數量上比肺泡Ⅰ型上皮細

胞多，但是其所占的肺泡上皮表面面積的比例不足春來了作文 10%[1]。肺泡Ⅱ型上皮細胞呈

立方形，胞漿里面含有板層小體是其基本特征，是鑒別肺泡Ⅱ型上皮細胞的主要依

據[2-3]。肺泡Ⅱ型上皮細胞是肺泡上皮組織干細胞，在正常的細胞更新和損傷修

復過程中它既可以分化為肺泡Ⅰ型上皮細胞，也可以通過有絲分裂來維持自身細胞

群[4-5]。肺泡Ⅱ型上皮細胞的損傷與多種肺部疾病有密切關系[6-7]，因此研究肺

泡Ⅱ型上皮細胞的病理生理特性具有重要的臨床意義。

維甲酸是維生素A的主要活性成分，在體內主要與維甲酸受體結合發揮生物學作

用。有研究顯示維甲酸不僅能促進發育期大鼠肺泡房間怎么畫 的形成，還能促進肺損傷后的修

復[8]，但也有研究表明維甲酸在肺氣腫模型的治療中無明顯作用[9]。

吸煙是導致慢性阻塞性肺病的主要病因，香煙煙霧包含大約1017個氧化劑/自由

基和4700多種化合物，其中丙烯醛是一種活潑的，不飽和醛，在環境中廣泛

存在，每支香煙大約產生10-500g丙烯醛，是人體丙烯醛暴露的主要環境來源。

丙烯醛是香煙燃燒所產生的主要有毒物質之一，丙烯醛進入細胞后可直接與DNA

結合形成加合物，導致DNA突變[10]，嚴重危害人體健康。

本實驗參考國內外研究，并對其方法加以改進，從大鼠肺組織中分離出高純度的肺

泡Ⅱ型上皮細胞，就維甲酸是否拮抗丙烯醛對大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞細胞周期的影

響進行實驗觀察。

1材料和方法

設計：對比觀察細胞學實驗。

時間及地點：于2011年6月至2012年3月在蘭州大學基礎醫學院病理學研究所

和蘭州大學醫學實驗中心完成。

材料：

實驗動物：健康清潔級雄性SD大鼠，鼠齡40-60d，體質量150-180g，由蘭州

大學實驗動物中心提供，許可證號：SYXK(甘)2005-0007。實驗過程中對動物的

處置符合2009年《Ethicalissuesinanimalexperimentation》相關動物倫理學

標準的條例。

維甲酸拮抗丙烯醛損傷肺泡Ⅱ型上皮細胞實驗的主要試劑及儀器：

試劑及儀器來源丙烯醛維甲酸、彈性蛋白酶、DNA酶Ⅰ、大鼠IgGBCIP/NBT試

劑盒鋼網西亞試劑公司Sigma公司倒置顯微鏡CO2培養箱酶標儀電子顯微鏡流

式細胞儀Promega公司北京世紀銀豐科技發展有限公司OLYMPUS/CK40

HERA/Cell150POVERWAVE/XJEOLJEM-1230BECKMANCOULTER

EPICS/XL

溶液Ⅰ，溶液Ⅱ：按照Dobbs等[1]的方法配置，溶液Ⅰ含140mmol/LNaCl，

5mmol/LKCl，2.5mmol/L磷酸鹽緩沖鹽，10mmo雜醬米線 l/LHEPES，6mmol/L葡

萄糖，0.2mmol/LEGTA。溶液Ⅱ含140mmol/LNaCl，5mmol/LKCl，2.5

mmol/L磷酸筆記本聲音小 鹽緩沖鹽，10mmol/LHEPES，2.0mmol/LCaCl2，1.3mmol/L

MgSO4。彈性蛋白酶消化液：用溶液Ⅱ配制，濃度為4.3U/mL；DNA酶Ⅰ溶液

用新鮮PBS液配制，質量濃度為250mg/L。丙烯醛用DMEM配制成濃度分別為

100mol/L、200mol/L、500mol/L的溶液(現配現用)，維甲酸(維甲酸濃度

參考李文斌等[11]的研究結果)先用乙醇配置成濃度為100mol/L的儲備液，再

用DMEM稀釋成1mol/L的工作液。

方法：

肺泡Ⅱ型上皮細胞的分離與純化：按照本實驗室已經建立的方法進行操作[12]，具

體介紹如下：清潔級雄性SD大鼠稱質量，戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉，

同時腹腔注射肝素鈉(40U/kg)使大鼠肝素化。待大鼠麻醉后浸入體積分數70%乙

醇溶液中消毒(注意：勿使大鼠吸入乙醇)，無菌術分離氣管做氣管插管，剖胸，暴

露心肺。在4.904kPa壓力下經肺動脈灌入溶液Ⅱ至肺成蒼白色，整體取出心肺。

經氣管插管向肺內注入溶液Ⅰ，灌洗8次，溶液Ⅱ灌洗2次，酶消化液灌洗1次。

37℃下經氣管插管(0.490kPa)持續向肺內注入酶消化液，消化15min后在含有

4mLDNA酶Ⅰ溶液的培養皿內把肺組織剪碎成1mm3左右的碎塊。整個消化過

程保持在20min以內。加入5mLFBS終止消化，把肺組織碎塊傾入250mL錐

形瓶內，在37℃往復水浴條件下130r/min搖晃2min。將所得組織碎塊和細胞

懸液順序通過4層用溶液Ⅱ預濕的紗布以及150m，15m和7.5m的濾網。

在整個過程中不提供正負壓力，收集濾液1000r/min離心8min，棄上清，用

DMEM調節細胞濃度至(2.0-3.0)109L-1。把細胞懸液接種到包被有大鼠IgG的

塑料平皿中，37℃孵箱孵育1h后輕輕搖晃，移出未貼壁細胞至細胞培養瓶內

37℃孵箱孵育20min，重復3次。移出未貼壁細胞，1000r/min離心8min

后棄上清，用DMEM完全培養基(含體積分數20%胎牛血清的DMEM液)重懸細

胞，把細胞懸液接種到細胞培養瓶內放入37℃孵箱培養。

活細胞計數：細胞純化完成后取100L細胞懸液與100L0.微笑的作用 4%錐蟲藍溶液混合

后，滴加到血球計數板中，顯微鏡下觀察，細胞未著色、發亮的為活細胞，被錐蟲

藍著色的為死細胞，數500個細胞，計算存活細胞百分比。

倒置相差顯微鏡觀察：細胞培養36h后換液，去除未貼壁細胞，倒置相差顯微鏡

下觀察細胞生長狀態，并拍照記錄。

透射電鏡觀察：細胞純化、離心后去上清，1%戊二醛固定，丙酮脫水，環氧樹脂

浸透包埋，超薄切片，檸檬酸鉛染色電鏡觀察、拍片記錄。

丹寧酸染色：參照Dobbs[3]的方法，細胞爬片風干后用新配置的PBS洗3遍，

用1%戊二醛固定液固定15min，用PBS沖洗2遍，每次10min，然后固定在

1%的四氧化鋨溶液中2h，PBS洗3遍，每次10min，用新鮮配置的1%單寧酸

(pH6.8)染色過夜，用PBS沖洗風干后中性樹膠封固。

MTT法檢測丙烯醛對肺泡Ⅱ型上皮細胞活性的影響，并確定最佳干預濃度：細胞

純化后，調整細胞懸液濃度為1106并接種到96孔培養板。待36h后分別設空

白對照組、陰性對照組和不同丙烯醛濃度組(500，200，100mol/L)，每組設4

個復孔分別與培養3，12，24h時棄培養基，在孔內加入20L5g/L的MTT，

放入體積分數5%CO2培養箱內繼續培養4h。

取出96孔培養板，每孔加入150LDMSO，氣浴恒溫振蕩器內避光輕輕搖晃10

min，用酶標儀570nm波長檢測吸光度(A)。

計算細胞生長抑制率，計算不同濃度藥物干預下細胞受抑制情況，然后選擇最佳丙

烯醛干預組，以備后續試驗。

流式細胞儀檢測細胞周期：分別取陰性對照組、丙烯醛干預組(根據MTT檢測結果，

選擇丙烯醛濃度為200mol/L，作用時間為3h)、丙烯醛加維甲酸組、維甲酸組

細胞各1瓶，用0.25%胰酶消化細胞，收集細胞懸液1000r/min離心棄上清，

沉淀用4℃PBS洗2遍，體積分數70%乙醇4℃固定12h以上，離心棄上清，

沉淀用4℃PBS洗2遍，加入1mLPI染液，常溫避光孵育30min，上流式細

胞儀檢測細胞周期。

主要觀察指標：MTT實驗觀察各組細胞A值，流式細胞術分析不同細胞周期各時

相細胞所占的百分比。

統計學分析：統計學處理者為第二作者，采用SPSS13.0軟件對實驗數據行單因

素ANOVA分析。

2結果

2.1活細胞計數結果細胞經黏附純化后所得細胞懸液，每只大鼠可獲得(37.4-

50.9)106個細胞，細胞活性≥90%(錐蟲藍染色)。

2.2倒置顯微鏡下觀察結果原代培養36h后，細胞呈島嶼狀或單個生長，細胞形

狀呈不規則三角形，胞漿內有空泡狀結構、可見豐富粗顆粒，見圖1。

2.3透射電鏡觀察結果細胞純化后離心，做透射電鏡標本，可見肺泡Ⅱ型上皮細

胞胞漿內有多個板層小體，有些板層小體呈內容物排空狀，細胞膜上有突起呈絨毛

狀結構，見圖2。

2.4單寧酸染色結果細胞爬片36h后染色，均明顯可見肺泡Ⅱ型上皮細胞胞漿內

有黑色顆粒——板層小體，計算細胞純度≥90%，見圖3。

2.5MTT法檢測細胞活性MTT法檢測結果顯示，丙烯醛作用3h后，肺泡Ⅱ型上

皮細胞活性與藥物濃度成劑量效應關系，見圖4。

Figure1Obrvationunderinvertedmicroscope：After36hculture,

alveolarepithelialcellstypeⅡprentedanisland-likegrowingfeature

(100)圖1大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞倒置顯微鏡下觀察結果(100)

Figure2Obrvationu六年級作文450字 ndertransmissionelectronmicroscopy：Abundant

typicallamellarbodiescouldbefoundinthecytoplasmofalveolar

epithelialcellstypeⅡ(8000)圖2大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞透射電鏡觀察結果

(8000)

Figure3Tannicacidstainingshowedthatagreatamountofgranules

(typicallamellarbodies)inthecytoplasmofalveolarepithelialcellstypeⅡ

werestainedblack(400)圖3大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞單寧酸染色結果(400)

2.6流式細胞儀檢測細胞周期見圖5。

Figure4CellviabilityofalveolarepithelialcellstypeIImeasuredbyMTT

methodaftertreatmentwithdifferentconcentrationsofacrolein(100,

200,500mol/L)圖4在100，200，500mol/L丙烯醛_作用3h后MTT法檢

測大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞活性(s)

Figure5CellcycleofalveolarepithelialcellstypeⅡdetectedusingflow

cytometry圖5流式細胞儀檢測大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的細胞周期

圖5可見，和陰性對照組相比，丙烯醛干預組肺泡Ⅱ型上皮細胞G1期細胞百分比

明顯增加。

維甲酸與丙烯醛共同干預組顯示，維甲酸拮抗丙烯醛的效果不明顯，肺泡Ⅱ型上皮

細胞G1期細胞百分比與丙烯醛干預組相比差異無顯著性意義。

維甲酸組與陰性對照組相比G1期細胞百分比沒有明顯變化。

3討論

雖然有很多關于肺泡Ⅱ型上皮細胞的細胞系，但是都不完全具備肺泡Ⅱ型上皮細胞

的表型特征，故原代分離和培養的肺泡Ⅱ型上皮細胞較為理想。本實驗世界杯對戰表 室主要綜合

了Dobbs等[1-3]的分離方法并加以改良，用普通成年雄性SD大鼠，成功分離出

了較高純度的肺泡Ⅱ型上皮細胞，能夠滿足本實驗需要，且本方法簡便易行，是對

肺泡相關疾病進行體外研究的理想實驗材料。

在實驗中作者盡可能縮短沖洗時間，從開胸到取出肺組織總時長控制在二三分鐘以

內。消化是肺泡Ⅱ型上皮細胞從肺組織分離的關鍵步驟，用4.2U/mL的彈性蛋白

酶消化肺組織，作用時間控制在20min以內，消化作用較好，分離出的細胞活性

大純度高。細胞純化方法很多，主要有密度梯度離心法、免疫黏附法、免疫磁珠法、

差速貼壁法、濾膜分離法及流式細胞儀篩選法等。采用免疫黏附法去除中性粒細胞、

淋巴細胞和巨噬細胞，是可靠簡便的方法，結合差速貼壁法和紗布鋼網過濾，可大

幅度提升細胞的純度。繼續培養36h后換液，此時大部分細胞呈島嶼狀生長，故

可方便地去除混入的血細胞成分，從而進一步提高細胞純度。通過電鏡觀察板層小

體是檢測肺泡Ⅱ型上皮細胞的金標準，但由于價格昂貴且設備不易普及等因素而限

制了其應用。單寧酸染色法簡單易行，特異性高，染色后可直接在光鏡下觀察到黑

色顆粒，可以用來鑒別細胞并計算細胞純度。

眾所周知，吸煙是導致慢性阻塞性肺病的主要病因[13]，全球80%-90%的慢性阻

塞性肺病是由于吸煙所致[14]。香煙煙霧包含大約1017個氧化劑/自由基和4

700多種化合物，其中丙烯醛是一種活潑的，不飽和醛，在環境中廣泛存在，

香煙煙氣中含有大量丙烯醛，每支香煙大約產生10-500g丙烯醛[15]，是人體

丙烯醛暴露的主要環境來源。丙烯醛是香煙燃燒的主要產物之一，具有親電子活性，

進入細胞后可直接與DNA結合形成加合物，導致基因突變[16]。

本實驗發現丙烯醛在極低濃度(200mol/L)下即可導致肺泡Ⅱ型上皮細胞活性明

顯下降，流式細胞儀檢測G1期細胞百分比明顯升高，說明丙烯醛抑制大鼠肺泡Ⅱ

型上皮細胞生長，并使細胞周期阻滯在G1期，同時觀察了維甲酸對香煙煙霧組份

丙烯醛刺激下原代培養的大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的干預效果，結果顯示維甲酸對丙

烯醛的拮抗作用微弱，沒有起到保護的效果，其作用環境及機制還需進一步深入研

究。

人們所熟知的類維生素A，包括視黃醇(維生素A)和維甲酸，能夠在多種器官中通

過調節形態發生，細胞增殖和分化而發揮作用。在呼吸系統中，有證據表明維甲酸

能夠影響與肺臟發育、成熟，以及受損傷以后為維護肺組織結構的完整性而進行的

修復相關的一系列進程[17]。

有研究表明全反式維甲酸能夠改善地塞米松誘導的出生后肺泡間隔形成障礙從而挽

救大鼠和小鼠的肺臟功能，也有實驗指出在彈性蛋白酶或香煙煙霧誘導的肺氣腫模

型小鼠或大鼠體內，反式維甲酸能夠使消失的肺泡間隔通過再生而重建，然而，亦

有大量的研究沒能發現反式維甲酸在其他一些肺氣腫模型中具有保護性作用，且目

前為止仍未發現其在患者身上有明顯的保護性作用，出現這種分歧的原因仍不清楚

[18]。

致謝：感謝蘭州大學醫學實驗中心對本實驗的大力協助。

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