炭疽桿菌的快速鑒定

炭疽桿菌的快速鑒定

王藝鈞

10生物技術3班 2

摘要

炭疽桿菌（Bacillus anthraci）屬于需氧芽胞桿菌屬，能引起羊、牛、馬等動物及人

類的炭疽病。炭疽桿菌曾被帝國主義作為致死戰劑之一。平時，牧民、農民、皮毛和屠宰工

作者易受感染。皮膚炭疽在我國各地還有散在發生，不應放松警惕。我們利用炭疽桿菌的特

性，通過微生物學檢查，觀察炭疽桿菌在含血平板上幼稚菌落待征、溶血和粘性,再進行高

價效噬菌體快速裂解試驗、青霉素紙片串珠試驗和活性炭NaHC03平板CO2培養物的莢膜腫脹

試驗,可在短時間內完成對炭疽桿菌的定性鑒定，而不需要對其深入分子水平的檢測。

1． 立項依據與研究內容

1.1 項目的立項依據

炭疽熱是一種古老的人獸共患傳染病。炭疽是由炭疽桿菌引起的人獸共患急性、熱性、

敗血性傳染病。其病理變化的特點是脾臟顯著腫大，皮下及漿膜下結締組織出血浸潤，血液

凝固不良，呈煤焦油樣。人感染后多表現為皮膚炭疽、肺炭疽及腸炭疽，偶有伴發敗血癥。

人類炭疽病是由于接觸病畜的皮毛、吸入帶病菌（芽孢型）塵埃，或進食未煮熟的病畜

肉類而感染。該病潛伏期約7天，但徹底發病多達60天，早期癥狀包括咳嗽，但很快會發

展為嚴重的呼吸障礙和痙攣。由于炭疽病起初的癥狀類似流感，非常容易被人忽略。一旦發

病，病人在幾天內就會死亡。因此，快速檢測出炭疽桿菌和有炭疽桿菌引起的癥狀的辨別對

臨床和治療有著重大的意義。

如今，炭疽桿菌的鑒別技術已近很成熟，如：免疫學檢驗技術、核酸檢驗技術、適配子、

肽核酸、生物傳感器、生物芯片、化學分析技術、核酸測序與指紋圖分析技術等等[2]。

1.2 項目的研究內容

1.2.1炭疽桿菌的特點

革蘭氏陽性細菌；長而直的大桿菌，菌體兩端平直；大小為1.0～1. 5um×3～5um，致

病菌中最大的；無鞭毛，不能運動。在病人、病畜體內多散在或呈2～3個短鏈排列，有莢

膜（紅色）。炭疽桿菌為兼性需氧菌，在12～44℃都能生長，最適生長溫度為37℃。最適

pH為7.3～7.6。

在活炭疽病畜體或死亡后未經解剖的尸體內，不形成芽胞。一旦體內炭疽桿菌暴露于空

氣中，接觸了游離氧，在一定溫度下(12--42℃)就會形成芽胞。芽胞呈卵圓形或圓形，位于

菌體中央或稍偏向一端。

1.2.2分離特性

從臨床患者和病畜標本中分離炭疽芽孢桿菌是比較簡便的,但從環境樣品中分離和鑒定

芽孢則相對較困難 ,主要是缺乏有效的富集方法 ,環境樣品中含有其它形成芽孢的需氧菌 ,

它們的過度生長可干擾芽孢發芽或干擾檢測。

氣溶膠釋放后 ,對污染區人或動物的采樣 ,采集鼻腔、 面部、 頭發內的樣品最為重要。

芽孢的如下特性有利于芽孢從環境樣品中的分離[3]: ①芽孢耐熱:樣品前處理時可以

加熱 63～65 ℃20 min殺死大部分繁殖體 ,并促進芽孢發芽;② 芽孢耐乙醇:樣品前處理時

可以用 50 %乙醇處理1 min殺死大部分繁殖體 ,因此從環境樣品中分離芽孢并不受細菌繁

殖體污染的干擾; ③芽孢的浮力較大:我們可以用蔗糖或雙相甘油-水分離芽孢。另外 ,芽孢

的疏水性使之與土壤顆粒結合緊密 ,給分離帶來了困難 ,因此 ,分離芽孢時一般用非離子

型去垢劑減少這種緊密結合 ,提高分離效率。

分離后的炭疽桿菌接種到LB培養基，注意無菌低溫4度保存，以備鑒定。

1.2.3培養特性

炭疽桿菌幼稚菌落:(1)呈典型獅子頭狀,邊緣不整齊,常有小尾突起,(2)均不溶血;(3)

菌落有粘性,用接種針挑取,拉絲現象明顯。選擇這樣的典型菌落是順利進行菌種鑒定的先決

條件。因此必須控制分離平板的孵育時間。血平板在37℃中孵育12~15小時即可，孵育時

間愈長,炭疽桿菌在平板上的菌落特征愈不明顯。在碳酸氫鈉的培養基中，孵育于CO2環境

下，也能形成莢膜，形成莢膜是毒性特征，有毒株在碳酸氫鈉平板，20%CO2培養下，形成

粘液狀菌落（有莢膜），而無毒株則為粗糙狀。

在普通瓊脂平皿培養基上生長成不透明、灰白色、扁平、表面粗糙的菌落，邊緣不整齊，

能形成幾個或數十個菌體相連的長鏈，低倍顯微鏡觀察呈卷發狀。在血液瓊脂平皿培養基上，

生長出濕潤粘稠的菌落，菌落周圍不溶血。

1.2.4最終鑒定

在大多數情況下,炭疽芽孢桿菌的鑒定是比較容易的。血瓊脂培養基上的菌落形態具有

很重要的鑒定意義 ,例如 ,表面無光澤、 菌落扁平、 白色或灰白色、 不溶血及邊緣呈卷

發狀等;如果加上其它一些培養特征 ,如無動力、 青霉素敏感、 噬菌體裂解、 在含碳酸氫

鈉的血瓊脂培養基(5 %～20 %CO2)上形成莢膜等 ,就可以認為這一菌株是具有毒力的炭疽芽

孢桿菌 ,其余的生化測試意義不大。而通過PCR技術擴增莢膜和毒素基因也可以達到鑒定的

目的[1]。

對不典型莢膜可以用 McFadyeans’ s試驗鑒別:將可疑菌落與數毫升血液混勻 ,37 ℃

孵育 4 小時 ,然后做血涂片 ,熱和酒精固定后 ,用亞甲藍 ( Poly2chrome emthylene blue)

染色 ,炭疽芽孢桿菌染成黑色 ,莢膜染成粉紅色。

雖然已發現一些炭疽芽孢桿菌的菌株不能產生莢膜 ,甚至還有人報道發現可產生莢膜

而不產生毒素的炭疽菌株。事實上 ,如果一個菌株滿足上面的鑒定指標 ,而只是莢膜或毒素

陰性 ,仍然可以鑒定為炭疽芽孢桿菌。

1.2.4參考文獻

[1] Turnbull P C B. Definitive identification of Baci llus anthracis 2a

[2] 楊瑞馥 ,韓延平 ,宋亞軍 ,杜宗敏 ,翟俊輝 ,甄蓓等.炭疽芽孢桿菌檢測鑒定技術研究

進展 [J] 微生物學免疫學進展 2002 年第 30 卷第 2 期:53-66

[3] Hail S , Rossi CA ,Luding GV , et al . Comparison of noninvasive sampling sites

for early detection of Bacil lus anthracis spores f rom rhesus monkeys after aerosol

exposure〔 J〕 . Mil Med 1999 ; 164(12) :8332837.

1.3 研究方案

1.3.1研究思路

提取樣品→顯微鏡觀察→血瓊脂培養基鑒定、營養培養基鑒定、青霉素串珠實驗、噬菌

體裂解和青霉素敏感實驗、碳酸氫鈉平板鑒定。

1.3.2標本采集和樣品處理

我們以土壤標本為樣品，在牲畜死亡或宰殺的地點，應取土壤標本以供檢查。一般要采

集表層土壤（10cm內），取150g左右。

①樣品加熱 63～65 ℃20 min殺死大部分繁殖體 ,并促進芽孢發芽；② 樣品用 50 %

乙醇處理1 min殺死大部分繁殖體 ,因此從環境樣品中分離芽孢并不受細菌繁殖體污染的

干；③用蔗糖（用量不能太多）溶解；④離心取上清液（1000rcf/min），溶于LB培養基中，

培養至OD600nm值為0.8~1.0，因為在這時候是菌體較多的時候，又不在衰老期，在4℃保

存，備用。

1.3.3顯微鏡檢查

步驟：涂片、革蘭染色及莢膜染色、顯微鏡檢查。

取末稍血液制成涂片后，染色鏡檢，發現有多量單在、成對或2～4個菌體相連的短鏈

排列、竹節狀有莢膜的粗大桿菌，即可初步認為有炭疽桿菌。因為血液中應為無菌，所以如

在血液內有特征明顯的菌，則可初步確定為炭疽桿菌。

1.3.4血瓊脂培養基的鑒定

取血瓊脂平板、營養瓊脂平板，制備好的菌液各涂布0.1ml，在37℃中孵育12~15小時，

觀察培養情況。

由上面的特性可知，在營養瓊脂平板中，炭疽桿菌粗糙不發光，比較扁平，有點兒象蠟

樣桿菌的菌落但較小，卷發狀，有的菌體形態不規則，有彗星狀拖尾，白或灰白色；在血瓊

脂平板中，生長出濕潤粘稠的菌落，菌落周圍不溶血。

如果出現這種情況，即可更進一步判斷為炭疽桿菌，否則，可以排除炭疽桿菌。

結果參考：血平板 營養平板

如果出現如圖所示的結果，可以確定為炭疽桿菌。如果實驗結果出現溶血現象，或營養

培養基上菌落異常，則可能是別的菌，或是平板遭到了污染。

1.3.5青霉素串珠試驗

用含有青霉素的小濾片紙(紙片蘸取每毫升含50~100u青霉素溶液或每片含1個u青霉

素的干燥紙片均可),貼在涂有細菌的平板上,孵育4~6小時用顯微鏡直按觀察。由于青霉素

由紙片向外擴散,總有一圈合適濃度使炭疽桿菌形成典型串珠,結果明顯,觀察方便。

因為炭疽桿菌對青霉素敏感，低濃度的青霉素（0.05～0.5單位/毫升）即可阻礙細胞

壁的形成，不能保持正常的桿狀外形。培養4—6小時可以看串珠實驗結果。

結果參考：

如果在青霉素紙片的輻射范圍內出現

如圖所示的串珠現象，則可以初步判

斷為炭疽桿菌，如果沒有出現菌落，

或是菌落形態異常，則可以排除為炭

疽桿菌。

1.3.6噬菌體裂解和青霉素敏感性

將制備好的菌液密集劃線接種于平板上，在劃線區內一處滴一診斷用炭疽噬菌體，另一

處貼一片青霉素紙片，紙片放下后，不能再動，37 ℃孵育8～24h后，觀察結果。

如果在滴噬菌體處有透明噬菌體斑，青霉素紙片周圍有明顯的抑菌環，便宜可斷定接種

物為炭疽芽胞桿菌。噬菌體實驗中因蠟樣芽孢桿菌可能會有假陽性，但因其對青霉素不敏感，

所以兩者同時做可以排除蠟樣芽孢桿菌。否則，結合以上幾個實驗，可以排除炭疽桿菌。

結果參考：青霉素平板 碳酸氫鈉平板

1.3.7碳酸氫鈉平板二氧化碳培養實驗

碳酸氫鈉平板二氧化碳培養試驗是鑒定炭疽桿菌及其毒力的重要項目。碳酸氫鈉培養基

中加入0.4%活性碳,以促進莢膜早期形成，又用固體培養物濃厚地點種于平板表面。二氧化

碳濃度可用CO2培養箱增至20~40%,使用極為方便。有毒力的炭疽桿菌于37℃孵育5小時即

能生長莢膜。取5小時培養物加以公雞制備的高效價抗炭疽莢膜血清，在玻片上作莢膜腫脹

試驗,出現莢膜特異反應者為有毒力的炭疽桿菌。因為炭疽桿菌的毒力、碳酸氫鈉平板上生

長的粘液狀菌苔和炭疽桿菌的莢膜三者有平行關系,現將它們聯合試驗。

活性炭NaHCO,平板CO2培養5小時后,莢膜腫脹試驗陽性的炭疽桿菌說明存在炭疽莢膜

抗原成份,結合該菌在空氣中培養生成粗糙的獅子頭狀菌落特點,可判斷為炭疽毒株。故莢膜

腫脹試驗不僅可測定細菌莢膜的抗原性,在一定條件下,可作為一種體外毒力試驗。

如果長不出莢膜，則不是炭疽桿菌；如果出現粗糙狀，則為無毒或毒性低的炭疽桿菌。

1.4 可行性分析

由于炭疽桿菌的研究比較深入和透徹，如今的炭疽桿菌的檢測方法已達十幾種，免疫學

檢驗技術、核酸檢驗技術、適配子、肽核酸、生物傳感器、生物芯片、化學分析技術、核酸

測序與指紋圖分析技術等等，但是有很多技術在如今我們學校的實驗室可能不具備設備和條

件。所以對炭疽桿菌的檢測，我們根據炭疽桿菌的特性設計實驗，依然能夠鑒別出炭疽桿菌。

對于準確的分子水平的PCR技術檢測炭疽桿菌的pox1和pox2兩個基因，只用這種方法就可

以檢測，但是如今PCR擴展要使用的引物由外面公司制備，從送出去序列到拿到引物，在這

段時間里，我們已經可以把我們上述的實驗完成了，所以PCR技術測核酸不符合我們所要求

的快速檢測。

在實驗室中已近有了我們實驗中所涉及的儀器和設備，試劑等。這是實驗順利進行得重

要保障。

2． 研究基礎與工作條件

2.1 工作基礎

實驗課和課后在實驗室做實驗積累的實驗經驗和操作熟練程度，由于炭疽研究比較透

徹，在培養過程中用到的培養基都已經有商品賣了，因此在實驗的過程中比較方便快速，還

有，這些實驗鑒定方法前人已經闡述得很清楚，因此，對實驗的起著很好的指導和參考作用。

2.2 工作條件

2.2.1儀器和設備

二氧化碳培養箱，普通培養箱，恒溫水浴鍋，電子天平，普通光學顯微鏡，超凈工作臺，

冰箱，滅菌鍋。

2.2.2材料

血瓊脂平板（BA）：取血液瓊脂基礎（商品）3.8 克，加熱溶解于100ml蒸餾水中，121℃

高壓滅菌15分鐘，冷至50~55℃時，無菌操作加入5％~10％（V／V）預溫至37℃的無菌脫

纖維羊血，混勻，傾入無菌平皿。

營養瓊脂平板：蛋白胨1g，牛肉膏0.3g，氯化鈉0.5g，瓊脂1.5～2g，蒸餾水100mL。

制法：將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水內，加入15%氫氧化鈉溶液校正pH至7.2～7.4。

加入瓊脂，加熱煮沸，使瓊脂溶化，121℃高壓滅菌15min，倒平板備用。

碳酸氫鈉平板:稱取碳酸氫鈉瓊脂基礎（商品）4.7g,加熱溶解于88ml 蒸餾水中, 121℃

高壓滅菌 15 分鐘,冷至 50℃左右時,加入10%無菌碳酸氫鈉溶液 12ml，充分搖勻 ,傾入無

菌平皿。

炭疽噬菌體：購買成品商品

青霉素敏感紙片：購買成品商品

脫纖維羊血：購買成品商品

2.2.3試劑

蒸餾水，50%乙醇，蔗糖，LB培養基，青霉素。

3． 其它要說明的問題

3.1實驗中，要保持無雜菌的污染，因此要做好器皿和材料的滅菌。

3.2在晚上完成平板的涂布，在培養箱中過夜培養，第二天早上就可以觀察到實驗結果，因

此，這個實驗計較方便。

3.3在碳酸氫鈉平板鑒定中，我們可以根據莢膜的情況，可以鑒別出炭疽桿菌毒性的有無和

強弱。