試驗六1、小鼠采精方法的研究

實驗六、小鼠采精方法

中國比較醫學雜志CHINESE JOURNAL OF COMPARATIVEMEDICINE

2005年4月第15卷 第2期April, 2005 Vol.15 No.2

鄭新民,李聚學,魏 雁,喬憲鳳,周荊榮

(湖北省農科院生物技術研究所,武漢 430072

小鼠是世界上研究最為詳盡的哺乳類動物[1]。但是目前人們仍然是通過手術法從小鼠附睪

中獲取精子,國內外尚無小鼠非手術法采精的報道。手術法采精為眾多的科學研究帶來了不

便:(1)手術法采精必須將雄鼠處死,分離其附睪和輸精管來獲取精子,過程繁瑣,費時費工,且造

成不必要的經濟浪費[2]。另外,從附睪中獲取的精子由于缺少副性腺中的諸多有益成分,精子

品質難以保證[3];(2)不利于小鼠生殖生理的研究,在醫學上,人們都是通過“殺雞取卵”式地宰

殺大量的雄鼠來獲取精子進行科研分析[4-6],不但造成了很大的經濟浪費,而且增加了實驗的

誤差和難度;(3)不利于某些動物模型的建立,例如,由于小鼠精子獲取繁瑣,人工授精技術不易

建立,精子載體轉基因技術尚無理想的動物模型,這極不利于該項研究的開展[7]。由此可見,

建立一種方便快速的小鼠非手術法采精技術對解決小鼠手術法采精中存在的問題、小鼠生殖

生理的研究和建立某些小鼠動物模型都是很有意義的。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級昆明小白鼠雄鼠,購自湖北省預防醫學科學院。合格證號為:SYXK(鄂)20035853。

1.2 小鼠假陰道抽吸器的制備

小鼠假陰道的制作:取一段長約2 cm,內徑8 mm的軟質透明塑料管,在其內側套上一層厚度約

0.1 mm的膠膜,膠膜要求透明且有良好的彈性。在塑料管中部鉆一直徑為2 mm的小孔,將一

外徑與小孔相當的硬質插管插入小孔中,深度與塑料管管壁厚度相當,小孔周圍用強力膠水密

封,向小管中輕輕吹入空氣即可將塑料管內側膠膜充起。將制好的小鼠假陰道與膠頭吸管相

連,小鼠假陰道抽吸器即制作完畢。

1.3 電刺激采精儀的制備

電刺激采精儀由電刺激發生器和直腸探子兩部分組成。電刺激發生器由交流變壓器、電流表、

電壓調節器,變頻器,電源開關等部件組成。直腸探子可用小塑料管自行制成,探子上裝有電極,

電極與電刺激發生器插座用電線相連。電刺激采精儀的特點:

電壓連續可調,范圍為0~20 V;頻率選擇范圍為0~50 Hz;通電間歇時間可根據不同情況自行選

擇。

1.4 小鼠采精實驗

1.4.1 小鼠保定:利用筒式法保定小鼠,小鼠保定筒可用與小鼠體軀相似的塑料筒制成,塑料筒

兩端鉆有插孔,一端鋸有缺口。待小鼠鉆入筒內后,迅速將鐵釘插入插孔中,限制小鼠伸縮,即可

將小鼠保定。將保定好的小鼠在筒內旋轉,使其生殖器暴露在缺口中,以利精液收集。

1.4.2 小鼠徒手法采精:小鼠保定后,用75%的酒精將其生殖器消毒,待酒精揮發后,用手指輕輕

按摩小鼠生殖器。

1.4.3 小鼠假陰道抽吸法采精:小鼠假陰道消毒后,用凡士林將其內側膠膜潤滑,從插管中輕輕

吹入空氣,待內側膠膜充起后,迅速將插孔堵住,以防氣體外逸。用手輕輕按摩小鼠生殖器,待小

鼠陰莖勃起后,將陰莖迅速吸入37℃預熱后的假陰道內,然后用手指擠壓吸管膠頭,小鼠陰莖

便在管腔負壓的作用下做活塞運動,這時可向假陰道內不斷吹入氣體,以增加膠膜對小鼠陰莖

的壓力。抽吸頻率可由慢至快,直至小鼠射精。

1.4.4 小鼠電刺激采精:直腸探子用75%的酒精消毒后,用石蠟油或凡士林將其潤滑,輕輕地插

入小鼠直腸中,深度約2.5~3 cm。如在插入過程中遇有阻力,則表明小鼠糞便尚未排出,這時將

探子退出,用手指輕揉小鼠下腹部,促使小鼠排便,然后再將直腸探子插入。打開電刺激采精儀,

以頻率為20 Hz,起點電壓為2 V,占空比為5P5 s秒通電刺激,刺激30 s后,電壓上升1~2 V,重復

以上步驟,直到小鼠生殖器充血勃起而向外突出,這時應作好集精準備。

1.4.5 精液的收集:小鼠精液剛射出時為白色粘稠液體,但會在短時間內凝固成白色固體,因此

應迅速收集精液到有稀釋液的離心管中。如伴有淡黃色液體流出,則為尿液,應用滅菌紗布迅

速擦干,以免污染精液。另外,在射精過程中,有透明液體伴隨精液流出,可用移液槍將其收集。

1.5 總精子量和精子活率的測定

反復吹吸精液,待精子在精液稀釋液中充分游離后,用血細胞記數板測定精子的密度和活率,

然后根據稀釋液的體積和所測定的精子密度計算總精子數。

表2 射精不同階段精子量和活率的比較

Tab.2 Comparisons of spermatozoa quantity and

motility at different ejaculation stages

項目 1 2 3 4

Item First Second Third Fourth

精子量(億)

Semen quantity 0.05 1.2 0.8 0.15

活率(%) 40 82 83 83

Motility %

從表2可以看出,第一階段射出的精子量(0.05億)很小,活率很低(40%)。精子主要富集在

第二(1.2億)和第三階段(0.8億),且所獲得的精子活率較高(分別為82%和83%)。第四階段獲

得的精子量較少(0.15億),但活率較高(83%)。

2.3 小鼠重復采精效果

用假陰道抽吸法和電刺激法采精后,間隔5 d,用同樣的方法重復采精,結果見表3。

表3 假陰道抽吸法重復采精結果

Tab.3 Results of repeated collection of men

by artifical vagina pump

重復次數 采精成功率(%) 精子量(億) 活率(%)

Frequency Rate % Semen quantity Motility %

(in hundred million)

第一次采精(First) 77a 2.3b 80c

第二次采精(Second) 73a 2.0b 81c

注:同一豎欄內相同標注者表示差異不顯著(The same superscripts in

a vertical column show no difference)

表4 電刺激法重復采精結果

Tab.4 Results of repeated men collection by electroejaculation

重復采精 采精成功率(%) 精子量(億) 活率(%)

Frequency Success rate % Semen quantity Motility %

第一次采精(First) 70a 2.0b 82c

第二次采精(Second) 75a 2.1b 83c

注:同一豎欄內相同標注者表示差異不顯著(The same superscripts in a

vertical column show no difference)

從表3和表4可以看出,與首次采精相比,假陰道抽吸法和電刺激法對小鼠進行重復采精

的成功率(73%和77%,75%和70%)、平均總精子量(2.0億和2.3億,2.1億和2.0億)和精子活率

(81%和80%,83%和82%)均差異不顯著。

3 討論

(1)小鼠個體小,其生殖器也較小,直接用手指進行徒手按摩很難控制力度,不能對小鼠陰

莖進行有效的刺激,且易導致小鼠生殖器官的感染,對8只小鼠用徒手法進行了采精嘗試,無一

例采出精子,故我們認為徒手法采精不適合于小鼠。小鼠假陰道抽吸采精器則能很好的解決

這一問題,它能較好地控制假陰道內壁對小鼠陰莖的壓力,其刺激頻率可以通過控制吸管抽吸

頻率得以調節,采精成功率可達77%。電刺激采精是通過脈沖電流刺激生殖器引起動物性興

奮并射精來達到采精目的[8]。該法在牛、狐貍、鹿、海貍鼠和多種野生動物上已成功地應

用[8-11]。我們將其應用于小鼠,獲得了70%的采精成功率。長期以來,人們已習慣于手術法從

小鼠附睪中獲取精子,而非手術采精則被忽視。我們的實驗結果卻表明:小鼠非手術法采精是

完全可行的。

(2)與其他動物不同,小鼠精液在射出體外的瞬間即發生凝固現象,這與小鼠的特殊性腺

凝固腺有關[12]。凝固腺分泌促精液凝固的蛋白成分,當射出的精液在體外遇到空氣,小鼠精

液便迅速發生凝固現象,精子主要附著在凝固物上。凝固物的作用是在剛交配的母鼠陰道中

形成陰道栓,阻止精子外流。與豬等家畜相似,小鼠射精也分成多個階段,第一階段射出的精液

精子含量少,且以死精居多,精子活率低[13]。小鼠精子主要富集在第二和第三階段,這兩階段

射出的精液精子活率高(81%~82%),末尾射出的精液所含的精子較少。

(3)小鼠重復采精實驗表明,小鼠可在休息一段時間后重復采精,假陰道抽吸法和電刺激

法對小鼠采精無明顯影響。假陰道抽吸器主要是根據小鼠自然交配的特點制作而成,對小鼠

生殖器刺激小,不會對生殖器造成器質性損傷。電刺激法在牛、狗熊、熊貓、小靈貓等多種

動物上都已證明其對動物生殖功能無不良影響,我們在采精中發現,在操作得當、刺激電壓適

當的情況下,電刺激采精對小鼠重復采精無顯著影響[8、14-16]。在電刺激采精中應當注意,

采精電壓不宜過高,一般以4~5 V為宜,不要超過10V,過高的電壓易灼傷小鼠生殖器及直腸壁,

還可造成小鼠陰莖過度充血,甚至出血。另外,在電刺激采精時,對小鼠輕微麻醉保定效果較好,

這樣操作方便,又可避免因小鼠劇烈掙扎而造成直腸探子對小鼠直腸的損傷。