海南淮山莖腐病菌對戊唑醇的敏感性測定

海南淮山莖腐病菌對戊唑醇的敏感性測定

趙志祥;陳圓;陳綿才;肖敏;肖彤斌

【摘 要】In order to provide practical and theoretical basis for the

prevention and control of Dioscorea op posita stem rot dia ,the

bioassay method of baline nsitivity was developed on the basis of the

effect of tebuconazole on the mycelium grow th and spore germination of

Fusarium oxysporum f .sp .dioscorea .Thirty-two strains were obtained by

single spore isolation .Virulence of tebuconazole on all of the strains was

tested by the methods of mycelium grow th and spore germination .Then

virulence regression equation was constructed and the nsitive

distribution was analyd .The results showed that mycelium growth of the

pathogen was affected by tebuconazole ,with the maximal EC50 of 0.407

005 μg/mL ,minimum EC50 of 0.063 797 μg/mL , and mean EC50 of (0.228

3 ± 0.008 5)μg/mL ,respectively .And spore germination was inhibited by

tebuconazole to a greater extent ,with the mean EC50 as (0.031 8 ± 0.024

2)μg/mL ,ranging from 0.002 550 μg/mL to 0.104 858 μg/mL .Normal

distribution analysis showed that the nsitivity of mycelium growth to

tebuconazole fitted well with a normal distribution function ,but that of

spore germination did not ,for which the span between the maximal EC50

and the minimum EC50 was big .In high concentration area ,there were still

innsitive strains .This may be related to the change of environment ,and

thus a few strains possd a certain resistance .%研究海南淮山莖腐病菌株

對戊唑醇的敏感性，以期為該病害的綜合防治提供實踐和理論依據。通過單孢分離

獲得32株莖腐病菌，分別采用菌絲生長速率法和孢子萌發法測定戊唑醇對各菌株

的毒力，并進行毒力回歸和敏感性分析。結果表明：戊唑醇對菌絲生長具有較強的

抑制作用，其抑制中質量濃度（EC50）最小值、最大值、平均值分別為0.063797、

0.407005、（0.2283±0.0805）μg/m L ；該藥對孢子萌發的抑制效果更明顯，

其 EC50最小值、最大值、平均值分別為0.002550、0.104858、

（0.0318±0.0242）μg/m L。正態分析表明：菌絲生長對戊唑醇的敏感性呈正態

分布；而孢子萌發的敏感性呈非正態分布，其最大EC50和最小EC50之間的跨度

較大，EC50表現不連續，在高質量濃度區仍有不敏感菌株存在，這表明在自然界

中存在個別抗藥性較強的淮山莖腐病菌株。

【期刊名稱】《河南農業科學》

【年(卷),期】2014(000)006

【總頁數】5頁(P89-93)

【關鍵詞】戊唑醇;淮山莖腐病;尖孢鐮刀菌;菌絲生長;孢子萌發;敏感性

【作 者】趙志祥;陳圓;陳綿才;肖敏;肖彤斌

【作者單位】海南省農業科學院農業環境與植物保護研究所/海南省植物病蟲害防

控重點實驗室，海南海口571100;海南省農業科學院農業環境與植物保護研究所/

海南省植物病蟲害防控重點實驗室，海南海口571100;海南省農業科學院農業環

境與植物保護研究所/海南省植物病蟲害防控重點實驗室，海南海口571100;海南

省農業科學院農業環境與植物保護研究所/海南省植物病蟲害防控重點實驗室，海

南海口571100;海南省農業科學院農業環境與植物保護研究所/海南省植物病蟲害

防控重點實驗室，海南海口571100

【正文語種】中 文

【中圖分類】S48

2011－2012年對海南省海口、臨高和澄邁等地淮山病害進行調查發現，根狀莖上

莖腐病發生嚴重，一般發病率在30%左右，嚴重地塊高達80%以上。經鑒定，其

病原為尖孢鐮刀菌薯蕷專化型（Fusarium rea）［1］。

由于海南淮山大量種植的時間較晚，2007年以后才陸續從廣東、廣西等地引進云

選1號、2號和3號品種開始大面積種植［2］，因此，對該作物上病害的研究較

晚，尤其是莖腐病作為一種新的病害在海南鮮有研究。迄今尚無抗莖腐病的材料，

生產上以化學藥劑——苯并咪唑類的多菌靈和甲氧基丙烯酸酯類的嘧菌酯防治為

主。然而長期單一使用這些化學藥劑，病菌易產生抗藥性［3］。

戊唑醇是一種羥乙基三唑衍生物，屬高效、廣譜、低毒的內吸性三唑類殺菌劑。與

傳統三唑類殺菌劑相比，戊唑醇不但能夠抑制真菌中麥角甾醇的生物合成，還具有

其自身的優勢和特性，即用戊唑醇處理后，菌絲中出現3種△5甾醇：△5－麥角甾

醇、△5－豆固醇和△5，22－豆固二烯醇，影響甾醇混合物的組成，從而擴大戊唑

醇的抗菌譜［4］。

目前，戊唑醇主要用于防治小麥［5］、水稻［6］、花生［7］、香蕉［8］和蘋

果［9］等作物上的真菌病害，在全球50多個國家的60多種作物上取得登記并廣

泛應用。本實驗室通過室內毒力測定發現，戊唑醇對淮山莖腐病菌有較好的防治效

果。然而，該病菌對戊唑醇的敏感性尚不清楚。為此，本研究通過檢測海口、澄邁、

臨高等地淮山莖腐病菌對戊唑醇的敏感性，繪制敏感性分布頻率圖，分析抗藥性產

生的可能性，以期為利用戊唑醇防治該病害提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 供試農藥

70%的戊唑醇WP由北京華戎生物激素廠生產，試驗前，先將其用無菌水配成有

效成分為10 mg／mL的母液備用。

1.2 供試培養基

培養莖腐病菌以及菌絲生長速率法測定淮山莖腐病菌對戊唑醇的敏感性試驗所用培

養基為PDA培養基，配方為：馬鈴薯200.0g，蔗糖20.0g，瓊脂粉15.0～20.0g，

蒸餾水1L，調節pH 值為7.2，121～126℃滅菌20min。抑制孢子萌發試驗所用

培養基為水瓊脂培養基（WA），其配方為：瓊脂粉15.0～20.0g，蒸餾水1L，調

節pH值為7.0，121～126℃滅菌20min。

1.3 供試菌株的分離

從海口云龍、臨高東英和澄邁大拉等淮山生產基地采集淮山病莖89份，用常規組

織分離法［10］分離莖腐病菌。然后按照劉永翔等［11］的毛細管印跡法（略作

修改）進行單孢分離。將病原菌接種于PDA平板上，28℃下培養6～8d，待菌絲

布滿整個培養皿之后取出，在無菌操作臺上用無菌水洗去氣生菌絲，繼續暗光培養

7d，無菌水洗下孢子，收集于1.5mL滅菌離心管中。同時，用打孔器在PDA平

板上打若干個培養基圓餅，并將其置于滅菌的空皿中，編號備用。取10μL孢子懸

浮液置于無菌空培養皿中，毛細管的一端插入孢子懸浮液后，在PDA平板上輕印

一下，在100倍視野顯微鏡下，觀察并統計印跡中的孢子數目。依據孢子數目將

孢子懸浮液稀釋相應的倍數后，重復上述操作，以確保每個印跡周圍大約只有1

個孢子。用毛細管蘸取稀釋后的孢子懸浮液，在小圓餅上輕印，并檢查印跡周圍孢

子數，將只有1個孢子的小圓餅放回無菌的PDA平板上，編號，28℃下暗光培養

6d，即得到莖腐病單菌株。

1.4 淮山莖腐病菌菌絲生長對戊唑醇的敏感性測定

參考劉穎超等［12］的菌絲生長速率法測定莖腐病菌菌絲生長對戊唑醇的敏感性。

將保存的淮山莖腐病各菌株接種于PDA培養基平板上，每菌株至少3板，28℃下

暗光培養5d，選取菌絲生長良好、布滿整個培養皿的平板，用打孔器（直徑

4mm）打若干個菌餅（各菌餅中菌絲生長速率基本一致）。取適量的戊唑醇母液，

加入溶化后冷卻到55℃左右的PDA培養基中，搖勻，制成最終質量濃度梯度為

0.05、0.15、0.25、0.5、2.5μg／mL的含毒 PDA 培養基平板。在無菌操作臺上

冷卻30min后，用接種針挑取菌餅，倒扣于含毒培養基中央，每皿1個菌餅。28℃

暗光條件下培養6d，采用傳統十字交叉法測量每皿中的菌落直徑，每處理3皿，

試驗重復2次。同時，每菌株設置3皿不含藥液的培養基培養作為對照。統計各

質量濃度下菌落生長直徑，計算菌絲生長抑制率。菌絲生長抑制率＝（對照菌落生

長直徑－處理菌落生長直徑）／（對照菌落生長直徑－菌餅直徑）×100%。查閱

抑制率－幾率值對照表，獲得幾率值，建立幾率值（y）和質量濃度對數（x）之

間的毒力回歸方程（y＝ax＋b），計算決定系數（R2）和各菌株的抑制中質量濃

度（EC50值）。

1.5 淮山莖腐病菌孢子萌發對戊唑醇的敏感性測定

采用抑制孢子萌發法［13］測定各莖腐病菌菌株對戊唑醇的敏感性。將100μL

（約200個孢子）孢子懸浮液涂布于含有戊唑醇（終質量濃度分別為0.001、

0.005、0.025、0.125、0.625μg／mL）的 WA培養基平板上，并設不含藥液的

對照，28℃下暗光培養12h，觀察孢子萌發情況，試驗重復2次。計算孢子萌發

抑制率，萌發抑制率＝（對照孢子萌發數目－處理孢子萌發數目）／對照孢子萌發

數目×100%。建立萌發抑制率對應幾率值（y）和質量濃度對數（x）之間的毒力

回歸方程，計算R2和EC50值。

1.6 數據分析

數據統計、排序，建立毒力回歸方程，計算R2、EC50值、標準方差和敏感性基

線即平均EC50值等均在Excel程序中進行。對各菌株菌絲生長的EC50值和孢子

萌發的EC50值，在SPSS 19.0統計軟件中進行單樣本K－S正態性分布檢驗，判

斷是否符合正態分布。同時，分別將菌絲生長的EC50值和孢子萌發的EC50值等

分成7份，統計每份中菌株的個數和頻率，在SAS 8.1軟件中，以等分值為橫坐

標，頻率為縱坐標，分別繪制各菌株菌絲生長EC50值和孢子萌發 EC50值的頻率

分布圖［14］。

2 結果與分析

2.1 淮山莖腐病菌的分離結果

從89份淮山莖腐病莖中分離菌株，純化后進行單孢分離和鑒定，得到32個淮山

莖腐病菌菌株，編號見表1。

表1 淮山莖腐病菌菌絲生長對戊唑醇的敏感性測定結果菌株 來源 回歸方程 R2

EC50值／（μg／mL）菌株 來源 回歸方程 R2 EC50值／（μg／mL）LG10－1

臨高 y＝1.027 6x＋5.751 9 0.980 5 0.185 481 LG1－2 臨高 y＝0.904 1x＋

5.507 1 0.987 7 0.274 900 LP5－3 海口 y＝1.134 0x＋6.069 4 0.981 2 0.114

025 BD6－5 海口 y＝0.808 1x＋5.588 2 0.987 5 0.187 111 DL－5 澄邁 y＝

0.794 7x＋5.596 0 0.973 0 0.177 828 BD6－4 海口 y＝0.944 6x＋5.451 4

0.971 3 0.235 017 BD7－2 海口 y＝0.998 9x＋5.481 4 0.954 6 0.329 686 BD8

－1 海口 y＝1.024 8x＋5.510 9 0.980 1 0.287 806 DL－8 澄邁 y＝1.137 9x＋

5.910 8 0.984 8 0.158 343 BL2－2 海口 y＝0.717 8x＋5.668 3 0.945 7 0.222

792 BD5－2 海口 y＝1.075 8x＋5.913 9 0.956 8 0.141 413 LG16－1 臨高 y＝

0.909 3x＋5.859 3 0.973 4 0.108 868 LG8－2 臨高 y＝0.762 4x＋5.473 0

0.999 5 0.239 662 LP3－2 海口 y＝1.085 8x＋5.552 8 0.976 5 0.246 661 BL6

－5 海口 y＝1.052 9x＋5.715 8 0.913 5 0.209 007 LG1－1 臨高 y＝0.892 2x＋

5.565 1 0.937 4 0.275 613 LG17－1 臨高 y＝1.102 4x＋5.513 9 0.958 3 0.341

822 LG2－1 臨高 y＝0.875 5x＋5.654 3 0.972 8 0.250 438 DL3－3 澄邁 y＝

1.449 5x＋6.732 5 0.991 4 0.063 797 LP2－4 海口 y＝1.009 7x＋5.607 1

0.975 8 0.275 994 LP8－1 海口 y＝1.179 7x＋5.460 5 0.918 6 0.407 005 BD5

－4 海口 y＝1.088 1x＋5.449 0 0.987 0 0.389 673 LG5－1 臨高 y＝0.892 0x＋

5.593 2 0.987 0 0.216 272 LP4－5 海口 y＝1.056 3x＋5.666 5 0.989 8 0.173

261 DL－13 澄邁 y＝0.927 9x＋5.660 1 0.863 7 0.194 357 DL－5 澄邁 y＝

1.097 0x＋5.548 8 0.991 9 0.228 876 BD6－3 海口 y＝0.952 6x＋5.585 1

0.948 3 0.243 108 LP3－1 海口 y＝1.058 1x＋5.607 6 0.989 2 0.265 950 LP9

－3 海口 y＝1.286 9x＋6.110 9 0.971 4 0.137 025 LP4－3 海口 y＝0.857 0x＋

5.490 6 0.985 6 0.343 795 BD7－3 海口 y＝1.208 4x＋5.753 1 0.970 6 0.238

122 LP2－5 海口 y＝1.028 1x＋5.876 4 0.982 8 0.140 475

2.2 淮山莖腐病菌菌絲生長對戊唑醇的敏感性

從表1可以看出：不同菌株對戊唑醇的敏感性差異較大，如EC50值最高為海口云

龍的LP8－1，EC50值為0.407 005μg／mL，而澄邁大拉的DL3－3菌株EC50

值則最低，為0.063 797μg／mL，最大值和最小值之間相差6.38倍。各菌株

EC50值的標準偏差為0.080 5，平均EC50值為（0.228 3±0.080 5）μg／mL。

從圖1可以看出，EC50值在0.210 8～0.259 8 μg／mL的菌株數最多，有9個，

其EC50值接近平均EC50值，同時，柱形圖也反映出所有菌株的EC50值之間較

連續；在SPSS 19.0統計軟件中對EC50值進行單樣本K－S正態性分布檢驗，得

Kolmogorov－Smimov Z＝0.505，漸進連續性P＝0.961，檢驗分布為正態分布，

EC50值表現連續性，說明這32個淮山莖腐病菌菌絲生長對戊唑醇的敏感性頻率

分布符合正態分布。截至目前，淮山莖腐病菌自然種群菌絲生長對戊唑醇無明顯的

抗藥性。

圖1 淮山莖腐病菌32個菌株菌絲生長對戊唑醇的敏感性頻率分布

因此，在海南遠離內陸這一特殊的地理環境中，對三唑類殺菌劑戊唑醇而言，淮山

莖腐病菌群體基本上還處于原始種群，故本試驗中，戊唑醇對菌絲生長抑制的平均

EC50值（0.228 3±0.080 5）μg／mL，可作為海南淮山莖腐病菌對戊唑醇的敏

感性基線。

2.3 淮山莖腐病菌孢子萌發對戊唑醇的敏感性

戊唑醇對淮山莖腐病菌孢子萌發抑制的EC50值介于0.002 550～0.104 858μg／

mL（表2），平均EC50值為（0.031 8±0.024 2）μg／mL。EC50值集中分布

在0.002 550～0.051 928μg／mL，個別孢子萌發的EC50值較高，如LG8－2

孢子萌發的EC50值最高，為0.104 858μg／mL；BD7－2和 LG5－1次之，分

別為0.096 895 μg／mL 和 0.095 411 μg／mL。 而 在0.051 928～0.095

411μg／mL，無其他EC50出現，說明EC50值表現不連續，在高質量濃度區仍

有個別不敏感菌株。

表2 淮山莖腐病菌孢子萌發對戊唑醇的敏感性測定結果菌株 來源 回歸方程 R2

EC50值／（μg／mL）菌株 來源 回歸方程 R2 EC50值／（μg／mL）LG10－1

臨高 y＝1.254 7x＋8.254 1 0.959 0 0.002 550 LG1－2 臨高 y＝0.659 5x＋

6.094 6 0.918 0 0.021 893 LP5－3 海口 y＝0.712 5x＋6.171 4 0.929 6 0.028

451 BD6－5 海口 y＝0.633 8x＋5.925 4 0.955 4 0.034 666 DL－5 澄邁 y＝

1.429 2x＋7.833 7 0.924 7 0.010 406 BD6－4 海口 y＝0.625 2x＋6.023 0

0.955 9 0.021 345 BD7－2 海口 y＝0.723 9x＋5.733 8 0.960 0 0.096 895 BD8

－1 海口 y＝0.616 6x＋6.013 6 0.944 1 0.023 922 DL－8 澄邁 y＝0.937 1x＋

6.567 3 0.974 6 0.021 257 BL2－2 海口 y＝0.612 3x＋5.937 9 0.923 3 0.030

123 BD5－2 海口 y＝0.774 0x＋6.118 0 0.958 6 0.035 942 LG16－1 臨高 y＝

0.701 0x＋5.744 3 0.927 7 0.051 928 LG8－2 臨高 y＝0.761 1x＋5.745 4

0.976 7 0.104 858 LP3－2 海口 y＝0.623 8x＋6.207 1 0.952 4 0.018 967 BL6

－5 海口 y＝0.841 2x＋6.689 7 0.907 5 0.009 802 LG1－1 臨高 y＝0.579 4x＋

5.887 8 0.950 4 0.023 966 LG17－1 臨高 y＝0.648 1x＋6.094 3 0.979 2 0.020

488 LG2－1 臨高 y＝0.616 6x＋5.981 8 0.914 3 0.033 443 DL3－3 澄邁 y＝

0.642 4x＋6.135 1 0.940 3 0.017 113 LP2－4 海口 y＝0.547 9x＋5.895 3

0.954 7 0.036 711 LP8－1 海口 y＝0.620 9x＋5.996 7 0.907 7 0.024 814 BD5

－4 海口 y＝0.665 3x＋5.884 7 0.928 1 0.037 592 LG5－1 臨高 y＝0.553 7x＋

5.565 0 0.956 2 0.095 411 LP4－5 海口 y＝0.523 6x＋5.995 9 0.904 4 0.024

261 DL－13 澄邁 y＝0.738 2x＋6.230 7 0.968 5 0.021 518 DL－5 澄邁 y＝

0.620 9x＋6.136 7 0.974 1 0.012 832 BD6－3 海口 y＝0.785 4x＋6.228 3

0.937 8 0.027 290 LP3－1 海口 y＝0.964 3x＋5.890 9 0.973 5 0.019 884 LP9

－3 海口 y＝0.615 2x＋6.063 6 0.940 5 0.018 668 LP4－3 海口 y＝0.600 9x＋

6.976 8 0.853 5 0.045 186 BD7－3 海口 y＝0.671 0x＋6.075 0 0.914 3 0.024

998 LP2－5 海口 y＝0.652 4x＋6.123 2 0.951 1 0.018 985

將所得32個EC50值在SPSS 19.0統計軟件中進行單樣本K－S正態性分布檢驗，

得Kolmogorov－Smimov Z＝1.405，漸進連續性P＝0.039＜0.05，檢驗敏感

性分布不屬于正態分布。如圖2所示，EC50值表現不連續，在高質量濃度區有拖

尾現象。這一結果表明，在自然菌株群體中，個別自發突變的菌株孢子萌發對戊唑

醇敏感性較差，表現出一定的耐藥性。

圖2 淮山莖腐病菌32個菌株孢子萌發對戊唑醇的敏感性頻率分布

3 結論與討論

抑制菌絲生長和孢子萌發試驗結果表明：海南淮山莖腐病菌菌絲生長和孢子萌發對

戊唑醇的敏感性較高。32個菌株菌絲生長對戊唑醇的敏感性呈正態分布，菌株的

EC50值分布連續，且大多集中在0.210 8～0.259 8 μg／mL，接 近 平 均 EC50

值（0.228 3±0.080 5）μg／mL，因此，該EC50值可作為海南淮山莖腐病菌對

戊唑醇的敏感性基線。但是，個別菌株孢子萌發對戊唑醇具有一定程度的耐藥性，

EC50值在高質量濃度區域有拖尾現象。

不同莖腐病菌菌株的EC50值存在差異，對菌絲生長抑制的最小EC50值為0.063

797μg／mL，最大為0.407 005μg／mL，相差6.38倍；而對孢子萌發抑制的

EC50值最小為0.002 550μg／mL，最大為0.104 858μg／mL，相差41.12倍。

這可能與自然環境中莖腐病菌的地理小種差異等生物和遺傳特性、不同淮山生產基

地的用藥情況以及光溫、雨水等復雜的環境條件有一定的關系。王文橋等［15］

報道，病原菌對殺菌劑的敏感性受病菌生物與遺傳特性、用藥狀況及環境條件等因

素的制約。此外，各菌株菌絲生長對戊唑醇的敏感性均低于其孢子萌發的敏感性。

這與李紅霞等［16］、Gullino等［17］的研究結果是一致的。李紅霞等［16］

對來自江蘇和海南的辣椒炭疽病菌進行敏感性測定，發現嘧菌酯抑制孢子萌發的活

性遠高于抑制菌絲生長的活性。研究發現，病原菌孢子萌發對線粒體的呼吸作用依

賴性較強，而菌絲在無性生長過程中，對線粒體呼吸作用的依賴性較弱［18］。

這可能是病原菌孢子萌發對藥劑敏感性較高的原因。

近幾年，淮山莖腐病在海南地區大面積發病，由于目前尚無淮山莖腐病菌對戊唑醇

產生抗藥性的報道，為避免或減少抗藥性的產生，在實際生產過程中可以將戊唑醇

作為防治淮山莖腐病的替代藥劑，與當地生產過程中大量使用的多菌靈和嘧菌酯交

替使用。鑒于莖腐病菌孢子萌發對戊唑醇敏感性較高的特性，可以在發病初期使用

低質量濃度的戊唑醇抑制孢子的萌發，從而有效地抑制病原菌的侵染，防止病原菌

大面積擴散。

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