造血干細胞分離培養方法

一 造血干細胞分離

（一）小鼠骨髓采集與單個核細胞懸液的制備

1 HES(羥乙基淀粉)沉淀法

抽取髓液500 m L按4∶1比例加入HES，自然沉降紅細胞后，分離上清。4℃400 g離心10 min

得細胞沉淀物，以1 %白蛋白鹽水液洗滌細胞2次。

2 percoll液密度梯度離心法

①按體積比為～2)∶1在骨髓液中加入淋巴細胞分離液。4℃,1 5 00 r / min，離心20 min。取

單個核細胞層，以1%白蛋白鹽水液洗滌3次。

②取鼠股骨和脛骨 , 在兩頭關節處切開骨骼 , 反復用培養基沖洗骨髓腔 , 隨后小心地逐滴將

細胞懸液加在淋巴細胞分離液上 , 2 000 r / min 離心 20 min。吸取離心后相交液面處的白色細胞

層即為單個核細胞。

3 Ficoll分離法

方法一 在15ml分離管中加比重為的Ficoll液，緩慢移入等量骨髓細胞懸液，整體平衡后低溫

離心2000r/min×20min,吸取白細胞層，用RPMI1640液親清洗后離心2000r/min×10min,取白細胞層

加RPMI1640液到10ml制成造血干細胞懸液樣本。

方法二 取無菌離心管1支，預先添加3mlFicoll(與骨髓細胞懸液體積1:1)，用滴管取單細胞懸

液3ml，沿離心管壁小心緩慢疊加于分離液面上，注意保持清楚的界面，室溫下水平離心2000rpm×

20分鐘，（后續在冰上進行）用毛細吸管插到云霧層，小心吸取單個核細胞，置入另一短中管中，

加入5倍以上體積的磷酸緩沖液PBS，1500rpm×10分鐘，L-DMEM洗滌細胞兩次，每次以1000r/min

離心10min，去上清液。（除第一步的室溫離心外，其余為低溫離心）。

取骨髓細胞懸液的方法是：取出大鼠腿骨將肌肉盡可能剔除，并用PBS緩沖液沖洗干凈。在超

凈臺中腿骨浸泡在PBS緩沖液中5min，之后在兩頭關節處切開骨骼 , 反復用PBS緩沖液沖洗骨髓腔，

從而得到骨髓細胞懸液。

（二）Linc-- kit+造血干細胞的分離純化。

去除 Lin細胞( 負篩選) : 帶有生物素的混合抗體標記成熟細胞 ; 抗生物素的磁珠吸附抗體標

記的成熟細胞 , 包括 T , B淋巴細胞、粒細胞、巨噬細胞以及它們的定向前體細胞 ; 細胞通過磁

場不被柱子吸附的包括造血干細胞和骨髓間質干細胞。收集CD117細胞( 正篩選)：帶有CD117抗體

的磁珠吸附CD117細胞 , 細胞通過磁場被柱子吸附的CD117細胞(具體操作步驟參照M iltenyi公司

MACS手冊)。

（三）根據細胞表面CD34抗原進行分離純化

流式細胞儀檢測骨髓CD34細胞：取50μL細胞懸液 , 加入μL CD45- FITC和10μL CD34- PE

充分混合 , 避光孵育15 min。以PBS液洗滌并加多聚甲醛固定液450μL固定 , 上機檢測。

磁性標記 CD34細胞：在細胞懸液中加入100μL Fc - R阻滯劑 , 再加入100μLCD34 磁珠標記

細胞 , 于4℃冰箱中充分混合孵育 30 min。用PBS 緩沖液洗滌細胞，離心10 min , 去上清液后再

以500μL PBS緩沖液重新懸浮細胞。

MiniMACS磁性分離、純化CD34細胞：將MS分離柱放置在MACS分離器的磁場中，以500μL PBS

緩沖液漂洗。以孔徑30μm的尼龍網或過濾器去除細胞懸液凝塊 , 細胞通過分離柱 , 以500μL PBS

+

+

+

+

++

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+

緩沖液沖洗 3次。 將分離柱從分離器中移出并放置在合適的試管中 , 于分離柱頂端滴注P BS 緩沖

液 1 m L, 用分離柱配備的活塞加壓將保留的細胞沖出。重復磁性分離步驟，將洗脫的細胞移至一個

新的漂洗過的MS分離柱洗滌，用500μL PBS 緩沖液洗脫保留的細胞。

二 造血干細胞培養

1 粒-巨噬細胞集落生成單位(GFU-GM)培養（CD34+細胞的培養）

采用甲基纖維半固體培養基體系進行集落培養。培養體系中含有50μg / L重組干細胞生長

因子( rhSCF)、10μg / Lrh GM-CSF、10μg / L重組白細胞介素( rhIL) -3。在1 mL培養體

系中加入1×10個有細胞。5 %CO , 37℃條件下培養14 d , 倒置顯微鏡下計數CFU-GM集落數。

2

2 MNCs與HSCs的體外培養

5

（1）MNCs體外培養：用含10 %小牛血清的高糖DMEM培養基培養 , MNCs以5×10個/ mL接種

于24孔板中，每孔1 mL；(2)HSCs體外培養：用無血清高糖DMEM培養基，HSCs以1×10個/ mL

接種于24孔板中。細胞均置37℃，5%CO飽和濕度培養箱中培養。

2

3 由MNC制備基質細胞層

4

4

取新鮮分離的單個核細胞1×10培養于1ml含10%胎牛血清的IMDM中,置于24孔培

養板中,于5%CO,37℃飽和濕度的CO孵育箱中,每7天半量換液1次,3周后培養孔底

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鋪滿了基質細胞,去除懸浮細胞,用PBS洗2遍后,用含有EDTA的胰蛋白酶消化,1500RD

照射后將1x10/ml基質細胞移種于24孔板中,每孔1ml,繼續培養2天備用。

4 由CD34細胞制備基質細胞層

取新鮮分離的臍血CD34細胞1x10培養于1ml無血清培養液(SCGM)中，加入細胞因子

FL+TPo+GM-IL-1+IL-6，細胞因子濃度為FL50ng/ml，TPO50ng/ml，GM一CSF、IL-1

和IL-6分別為10ng/ml，置于24孔培養板中，于5%CO，37℃飽和濕度的CO孵育箱中,

22

每7天半量換液1次，3周后培養孔底鋪滿了基質細胞，去除懸浮細胞，用PBS洗2遍后,

用含有EDTA的胰蛋白酶消化，1500拉德照射后將1xl了/ml基質細胞移種于24孔板中，

每孔1ml，繼續培養2天備用。

+5

+

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4