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博士學位論文
微納米結構羥基磷灰石對骨髓間充質干細胞成骨分化
的調控研究
作者姓名：趙燦燦 __________________
指導教師: 常江研究員博士__________
中國科學院上海硅酸鹽研究所_______
學位類別: 工學博士_________________ 學科專業: 材料學__________________ 培養單位: 中國科學院上海硅酸鹽研究所_______
2018年6 月
Regulation of osteogenic differentiation of bone marrow menchymal stem cells by Hydroxyapatite Bioceramics with Micropattern and Nanostructure
A disrtation submitted to
University of Chine Academy of Sciences
in partial fulfillment of the requirement
for the degree of
Doctor of Engineering
in Materialogy
By
Zhao Cancan
Supervisor: Professor Chang Jiang
Shanghai Institute of Ceramics, Chine Academy of Sciences
June 2018
中國科學院大學
研究生學位論文原創性聲明
本人鄭重聲明：所呈交的學位論文是本人在導師的指導下獨立進行研究工作所取得的成果。盡我所知，除文中已經注明引用的內容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經發表或撰寫過的研究成果。對論文所涉及的研究工作做出貢獻的其他個人和集體，均已在文中以明確方式標明或致謝。
本人完全意識到本聲明的法律結果由本人承擔。
作者簽名：
日期：
中國科學院大學
學位論文授權使用聲明
本人完全了解并同意遵守中國科學院有關保存和使用學位論文的規定，同意中國科學院上海硅酸鹽研
究所保留并向國家有關部門和機構送交論文的復印件和電子版，允許該論文被查閱和借閱。本人授權中國科學院上海硅酸鹽研究所可以將本學位論文的全部或部分內容編入有關數據庫進行檢索，可以采用影印、縮印或其他復制手段保存、匯編本學位論文。
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本學位論文屬于：
□保密，在年解密后適用本授權書。
不保密。
作者簽名：導師簽名：
日期：日期：
摘要
摘要
骨是人體中最堅硬的組織，這種優異的力學性能與它本身的微納米多級有序結構密不可分。人工合成
的羥基磷灰石（Ca10(PO4)6(OH)2，HA）因與骨的無機成分相似、具有良好的生物相容性和骨引導性，被廣泛應用在骨組織工程中，但是傳統燒結制備的HA缺少骨誘導性能。前期初步的研究顯示，羥基磷灰石陶瓷表面微米結構和納米結構都能夠影響成骨細胞的粘附、增殖、分化，植入體內能夠促進成骨。但是關于微米和納米結構在促進成骨中如何起作用，特別是羥基磷灰石生物陶瓷的微米和納米結構的促成骨效應是否有區別還不清楚。而微米、納米兩種結構組合是否會產生出更加優異的促成骨性能，是設計優化生物活性骨修復材料的關鍵。然而由于陶瓷本身的脆性，直接在羥基磷灰石陶瓷表面構造圖案化結構具有很大的挑戰。值得注意的是，作為臨床應用的骨修復材料，在植入體內后會伴隨著相應的降解，那么結構在因降解發生變化前是否能對細胞產生足夠的活性刺激以促進成骨，也是骨植入材料設計需要考慮的因素。因此，本論文分別在HA陶瓷表面構建了微、納米結構，并分別研究了其對成骨性能的影響；進一步研究了微納米組合結構的作用，并比較了微米和納米結構在成骨分化中起到的作用以及組合結構協同促進成骨分化的機制；最后探討了材料降解前微納米結構對成骨分化激活作用的時效性問題。具體研究內容和結果如下：采用有序尼龍網篩為模板，干壓成型制備得到具有有序微米圖案化結構的HA生物陶瓷。選擇不同目數的尼龍網篩，來實現對微米圖案化尺寸的調控。體外細胞實驗發現，微米圖案化結構能夠促進細胞的粘附、增殖和成骨分化。并且隨著微米圖案化尺寸的減小，細胞的成骨分化能力增強。尤其是圖案化尺寸與細胞直徑最為接近的樣品，具有最優的促成骨分化能力。這表明圖案化尺寸對細胞生物學功能有調控作用。有序微米圖案化結構有望成為植入體表面結構設計的有效途徑。
為了尋找能夠與有序微米圖案化結構復合、且生物學性能較優、結構較為精細的納米結構，我們首先以光滑表面的HA為基底，簡易調控去離子水的pH值分別為3、7和11，水熱制備表面具有不規則納米粗糙度和納米棒的HA陶瓷。體外細胞實驗表明，表面結構能夠促進細胞的粘附、增殖和分化，但相比不規則
微納米結構羥基磷灰石對骨髓間充質干細胞成骨分化的調控研究
納米粗糙度，納米棒結構具有更明顯的促成骨能力。因此，我們將選擇納米棒結構作為下步與有序微米圖案化結構復合的結構。此外，我們采用乙二胺四乙酸二鈉鈣（EDTANa2Ca）作為鈣源對納米棒結構進行優化，并將優化后的納米棒作為次級結構引入到有序微米圖案化上。這部分將為在有序微米圖案化結構上引入次級納米棒結構奠定了基礎。
在前面兩部分的基礎上，采用模板法和水熱法結合，制備出微納米組合結構的HA。研究發現微、納米結構以及組合結構，能夠促進蛋白的選擇性吸附，尤其是組合結構的效果最為明顯，這一結果與材料對整合素的作用密切相關。體外細胞實驗發現，微、納米結構以及組合結構，能夠促進細胞的粘附、增殖和分化，并且與單級微、納米結構相比，組合結構具有協同促生物學性能的作用。有趣的是，在誘導成骨分化過程中，微、納米結構在整合素、BMP2信號通路以及細胞間相互作用的激活中均起到了不同的作用，這可能是導致微納米組合結構具有協同促成骨效應的機制。另外，微納米結構對整合
素激活和成骨分化上的協同效應，不僅來源于微納米結構與細胞接觸起到的直接激活作用，還包括表面結構通過促進蛋白質選擇性吸附進而促進生物活性的間接作用。其中，直接作用機制可以總結為：當細胞種植在材料表面時，表面結構首先激活整合素，然后進而激活BMP2信號通路和細胞-細胞間相互作用，而被激活的BMP2反過來也會繼續激活整合素和細胞-細胞間相互作用。
結合前面三部分內容，我們采用微米、納米、組合結構的HA作為研究對象，探究微納米結構對細胞刺激多長時間，可以使細胞產生持續性的成骨分化；以及通過移除材料來結束結構刺激后，多長時間內這種激活效應仍然會調控細胞的成骨分化。研究發現，微納米結構對細胞的成骨分化具有早期激活效應，并且當結構刺激結束后，成骨效應仍然具有持續效果。此外，我們的研究還發現，當材料表面的結構對細胞前期刺激作用時間越長，刺激結束后這種激活效應在后期表達越明顯。并且，與單級結構相比，細胞在受到組合結構的前期刺激后，后期的持續性成骨分化效應表達也最為明顯，并且微米和納米結構差異性不大。因此，我們在今后設計具有表面結構的材料時，需要考慮結構的穩定性。
關鍵詞：羥基磷灰石，微米圖案化結構，微納米組合結構，協同作用，激活效應
