基因重組酵母工程菌優(yōu)化表達(dá)人源膠原蛋白_劉斌

2023年12月4日發(fā)(作者：鄭州大學(xué)遠(yuǎn)程教育學(xué)院官網(wǎng))

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第35卷第4期2011年8月南京理工大學(xué)學(xué)報(bào)JournalofNanjingUniversityofScienceandTechnologyVol．35No．4Aug．2011基因重組酵母工程菌優(yōu)化表達(dá)人源膠原蛋白劉斌，郭紅麗，鈕小松，張小霞，楊樹林（南京理工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院，江蘇南京210094）要：通過(guò)響應(yīng)曲面法（RSM）優(yōu)化巴氏畢赤酵母基因工程菌GS115/pPIC9KG6表達(dá)高親水性重組人源膠原蛋白的搖瓶培養(yǎng)條件。采用Box－Behnken設(shè)計(jì)（BBD）考察初始誘導(dǎo)pH值、溫度摘利用DX7Trial軟件設(shè)計(jì)和甲醇添加量三個(gè)主要影響因子對(duì)重組人源膠原蛋白表達(dá)量的影響，實(shí)驗(yàn)方案，根據(jù)該方案設(shè)置不同培養(yǎng)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并測(cè)定相關(guān)參數(shù)。響應(yīng)面分析確定的最優(yōu)因素水平組合為：初始誘導(dǎo)pH值為5．0，誘導(dǎo)溫度為28℃，甲醇添加量為2．2%/24h。通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵的內(nèi)在因素水平，找出最佳條件，為利用其指導(dǎo)在發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度發(fā)酵生產(chǎn)人源膠原蛋白奠定基礎(chǔ)。Behnken設(shè)計(jì)關(guān)鍵詞：巴氏畢赤酵母；重組人源膠原蛋白；響應(yīng)曲面法；Box-中圖分類號(hào)：Q815文章編號(hào)：1005－9830（2011）04－0558－05OptimizationofFermentationConditionsofGeneticallyEngineeredPichiapastorisExpressingRecombinantHuman-sourceCollagenLIUBin，GUOHong-li，NIUXiao-song，ZHANGXiao-xia，YANGShu-lin（SchoolofEnvironmentalandBiologicalEngineering，NUST，Nanjing210094，China）Abstract：Responsurfacemethodology（RSM）isudtooptimizethefermentationconditionsofge-neticallyengineeredPichiapastoris（GS115/pPIC9KG6）expressinghighlyhydrophilicrecombinanthuman-sourcecollagen．Box-Behnkendesign（BBD）isintroducedtoestimatetheimpactofinitialin-ducementpH，temperatureandadditionamountofmethanol．Anexperimentisdonebyttingdiffer-entcultureconditionsaccordingtotheschemedesignedthroughtheDX7Trialsoftware，andthecor-relationalparametersaredetermined．TheRSManalysisresultshowsthattheoptimalscaleoffactorsis：initialinducementpH5．0，temperature28℃，additionamountofmethanol2．2%/24h．Theex-perimentofferspreciconditionsforhighdensityfermentationperformedinfermenter．Keywords：Pichiapastoris；recombinanthuman-sourcecollagen；responsurfacemethodology；Box-Behnkendesign收稿日期：2010－09－20修回日期：2011－06－10“863”基金項(xiàng)目：國(guó)家計(jì)劃資助項(xiàng)目（2008AA12A218）；教育部博士點(diǎn)基金（23）E-mail：goldendays2002@126．com；通作者簡(jiǎn)介：劉斌（1971－），男，博士生，主要研究方向：基因工程技術(shù)的應(yīng)用，E-mail：訊作者：楊樹林（1953－），男，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：微生物代謝調(diào)控與基因工程，yshulin@mail．njust．edu．cn。總第179期劉斌郭紅麗鈕小松張小霞楊樹林基因重組酵母工程菌優(yōu)化表達(dá)人源膠原蛋白559膠原蛋白具有獨(dú)特的組織結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特對(duì)維護(hù)細(xì)胞、組織、器官的正常生理功能和性，損傷修復(fù)有重要作用，同時(shí)膠原蛋白具有低免可生物降解、良好的生物相容性和機(jī)械疫原性、作為生物醫(yī)用材料廣泛應(yīng)用于醫(yī)性能等特點(diǎn)，［1，2］。膠原蛋白傳藥、組織工程和化妝品等領(lǐng)域統(tǒng)的也是目前最主要的生產(chǎn)方法是利用酸堿法或酶法處理豬或牛等動(dòng)物的結(jié)締組織中提［3，4］，取但從此類動(dòng)物組織中提取的膠原蛋白為水不溶性蛋白，可加工性很弱，并且提取過(guò)程中會(huì)或多或少喪失其部分生物活性，同時(shí)其提取物含有動(dòng)物疾病病毒隱患，應(yīng)用于人體時(shí)易產(chǎn)生排異反應(yīng)，從而很大程度限制了膠原蛋白的生產(chǎn)應(yīng)用［1，2］1．21．2．1培養(yǎng)方法種子培養(yǎng)從新鮮MD平板上挑取單菌落接種到50mL30℃和250r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)BMG培養(yǎng)基中，然后接入200mLBMG培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至夜，OD600達(dá)5．0～6．0。1．2．2搖瓶發(fā)酵6000r/min離心10min收集菌體，以100mL的BMM培養(yǎng)基重新懸浮菌體，使菌濃OD600250為2．0。調(diào)至所需pH值后，在選定的溫度下，r/min培養(yǎng)培養(yǎng)72h，每24h補(bǔ)加甲醇至一定濃度。1．3分析方法重組人源膠原蛋白濃度：發(fā)酵液經(jīng)10000PAGE凝r/min離心10min得上清液，進(jìn)行SDS-電泳膠經(jīng)凝膠成像掃描后采用Quantity膠電泳，One4．5．2軟件分析計(jì)算蛋白濃度。1．4RSM優(yōu)化發(fā)酵條件在前期的單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取初始誘導(dǎo)pH值、溫度和甲醇添加量三個(gè)關(guān)鍵因素為自變量，以重組人源膠原蛋白表達(dá)量為響應(yīng)值，采用RSM［9］中的BBD對(duì)巴氏畢赤酵母發(fā)酵表達(dá)重組人源膠原蛋白的條件進(jìn)行優(yōu)化。利用DX7Trial軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，根據(jù)該方案設(shè)置不同培養(yǎng)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并測(cè)定相關(guān)參數(shù)。。鑒于此，利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組膠原蛋白成為近幾年該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因重組技術(shù)，可以在動(dòng)物［6］［7］、植物和微生物表達(dá)體系獲得重組人膠原蛋白，從而可解決傳統(tǒng)提取方法存在的如［5］豬瘟或瘋牛病病毒隱患等缺點(diǎn)，同時(shí)也改善了膠原蛋白的親水性、免疫排異性等，但目前利用上述不同表達(dá)體系制備的膠原蛋白尚存在水溶性差和表達(dá)量低等缺陷。針對(duì)此問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)室基于人Ⅲ型膠原蛋白膠原域序列特征，以改善膠原蛋白水溶性和提高表達(dá)量為目的，利用蛋白質(zhì)工程、分子生物學(xué)及基因重組技術(shù)，設(shè)計(jì)并人工合成了一段編碼具高親水性的Gly－X－Y三肽重復(fù)序列重組人源膠原蛋白的基因單體，采用同向串聯(lián)方式，構(gòu)建了含六個(gè)單體的蛋白將pPIC9KG6電轉(zhuǎn)化巴氏表達(dá)載體pPIC9KG6，畢赤酵母（Pichiapastoris），經(jīng)G418篩選得到高拷貝重組酵母基因工程菌；通過(guò)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)［8］重組人源膠原蛋白。本文采用響應(yīng)曲面法（Responsurfacemethodology，RSM）中的Box-22．1結(jié)果與討論實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果BBD的因素水平見表1。用A、B和C分別代表初始誘導(dǎo)pH值、甲醇添加量和溫度三個(gè)因素，設(shè)計(jì)了三因素三水平實(shí)驗(yàn)。按照5個(gè)中心點(diǎn)、12個(gè)析因點(diǎn)設(shè)計(jì)安排實(shí)驗(yàn)，共17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，區(qū)域中心點(diǎn)即零點(diǎn)的重復(fù)多次是為了估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。表1因素BBD的因素水平符號(hào)ABC水平－13．512605228+16．5330Behnken設(shè)計(jì)（BBD）優(yōu)化搖瓶發(fā)酵表達(dá)重組人源膠原蛋白條件，為實(shí)現(xiàn)基因重組酵母工程菌發(fā)酵法制備重組人源膠原蛋白及其在醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。11．1材料與方法菌株pH值甲醇添加量%/24ht/℃重組巴氏畢赤酵母Pichiapastoris（GS115/［8］pPIC9KG6），His+，Mut+，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。560表2試驗(yàn)號(hào)17pH值3．56．53．56．53．56．53．56．5555555555甲醇添加量/（%/24h）322222南京理工大學(xué)學(xué)報(bào)BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)的預(yù)測(cè)和實(shí)測(cè)值t/℃2828282826263828282828·L－1）實(shí)際值/（mg16．2726．2420．5720．438．213．0817．5013．486．4611．159．1515．0829．3529．9229．9528．0230．87·L－1）預(yù)測(cè)值/（mg17．1322．3524．4619．577．477．0913．4914．226．348．0012．3015．2029．6229．6229．6229．6229．62第35卷第4期殘差－0．863．89－3．890．860．74－4．014．01－0．740．123．15－3．15－0．12－0．270．300．33－1．601．25學(xué)生化殘差－0．4802．179－2．1790．4800．414－2．2452．245－0．4140．0661．765－1．765－0．066－0．0850．0930．103－0．5020．3912．2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析以重組人源膠原蛋白表達(dá)量為響應(yīng)值，回歸擬合后各試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響用函數(shù)表示：R=a0+a1A+a2B+a3C+a4AB+a5AC+a6BC+a7A2+a8B2+a9C2（1）采用統(tǒng)計(jì)軟件DX7Trial對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元得到二次回歸方程模型（編碼形式）：回歸擬合，R=29．62+0．085A+1．14B+3．29C－2．53AB+0．28AC+0．31BC－4．32A2－4．43B2－14．74C2（2）實(shí)驗(yàn)方差分析及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3。表3BBD實(shí)驗(yàn)方差分析F值p值變異源平方和自由度均方顯著性9141．6111．11660．0022*模型1274．48A0．0610．060．00450．9482B10．37110．370．81440．3968C86．53186．536．79260．0351*AB25．55125．552．00600．1996AC0．3110．310．02420．8808BC0．3810．380．03020．867078．52178．526．16430．0420*A282．48182．486．47500．0384*B22914．311914．3171．7756＜0．0001*C84．78328．2625．72290．0045*失擬4．3941．10誤差總和1357．09162B2、在此實(shí)驗(yàn)中，自變量一次項(xiàng)C，二次項(xiàng)A、2和C顯著（均p＜0．05），表明溫度的一次項(xiàng)，初始誘導(dǎo)pH值和甲醇添加量的交互作用對(duì)重組人源膠原蛋白表達(dá)量的影響不顯著（p＞0．05）。2方差分析中的確定系數(shù)R=0．9346，校正確定22系數(shù)RAdj=0．8505。RAdj可顯示所選模型的擬合程Jogleker和度，即預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間的相關(guān)性，May建議一個(gè)擬合較好的模型R2至少應(yīng)為0．80［10］，說(shuō)明可用此模型擬合巴氏畢赤酵母發(fā)酵表達(dá)重組人源膠原蛋白的工藝過(guò)程，進(jìn)行初步分析和預(yù)測(cè)。2．3因素水平優(yōu)化巴氏畢赤酵母發(fā)酵表達(dá)重組人源膠原蛋白的響應(yīng)面及對(duì)應(yīng)的等高線圖分別如圖1～3所示。圖1顯示重組人源膠原蛋白表達(dá)量受pH值和甲醇添加量的交互影響。左圖為pH值與甲醇添加量對(duì)重組人源膠原蛋白表達(dá)量的響應(yīng)面圖，右圖為相應(yīng)的等高線圖。在所選定的水平范圍內(nèi)，保持A（pH值）為一定值，隨著B（甲醇添加量）的增加響應(yīng)R（重組人源膠原蛋白表達(dá)量）快速增大，達(dá)到峰值后又開始下降。同樣，保持B為一定值，隨R也出現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。等高著A的增加，線近乎圓形，表明pH值與甲醇添加量之間的交互作用較弱，圖示結(jié)果與表3數(shù)據(jù)分析結(jié)果相吻合。圖2顯示在選定的范圍內(nèi)保持A（pH值）為一定值，隨著C（溫度）的增加響應(yīng)值R（重組人源膠原蛋白表達(dá)量）先增大到最大，隨后又下降。同樣R隨A的變化趨勢(shì)也如此。等保持C為一定值時(shí)，高線顯示A與C的交互作用也不強(qiáng)，但相比于A和B卻顯著了很多，這個(gè)判斷通過(guò)對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)pAB=0．1996）。行分析也可得出（pAC=0．8808，誘導(dǎo)pH值、甲醇添加量和溫度的二次項(xiàng)對(duì)重組人源膠原蛋白表達(dá)量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著影響；而初始誘導(dǎo)pH值和甲醇添加量的一次項(xiàng)及溫度、初始總第179期劉斌郭紅麗鈕小松張小霞楊樹林基因重組酵母工程菌優(yōu)化表達(dá)人源膠原蛋白561圖1pH值、甲醇添加量對(duì)重組人源膠原蛋白表達(dá)量的響應(yīng)面（a）和等高線（b）圖2pH值、溫度對(duì)重組人源膠原蛋白表達(dá)量的響應(yīng)面（a）和等高線（b）R也是呈現(xiàn)先圖3顯示隨著B和C的增大，達(dá)到最大值后又下降的趨勢(shì)。且由圖中很明顯可以看出溫度對(duì)響應(yīng)值R的影響顯著，這與表3數(shù)據(jù)分析中溫度的p值很小以及模型中溫度因素的二階影響系數(shù)很大相符。由圖1～3及數(shù)據(jù)分析軟件DX7Trial，可以得到三個(gè)因素的最優(yōu)值分別為：初始誘導(dǎo)pH值4.95，誘導(dǎo)溫度28．16℃，甲醇添加量2．16%/24h。在此組合下響應(yīng)值R在試驗(yàn)區(qū)域內(nèi)可達(dá)最優(yōu)點(diǎn)，即重組人源膠原蛋白表達(dá)量最大，理論值為29．87mg/L。圖3溫度、甲醇添加量對(duì)重組人源膠原蛋白表達(dá)量的響應(yīng)面（a）和等高線（b）5622．4模型適合性檢驗(yàn)殘差分析［9］南京理工大學(xué)學(xué)報(bào)第35卷第4期見圖4。優(yōu)化了內(nèi)計(jì)學(xué)方法對(duì)該模型進(jìn)行了顯著性檢驗(yàn)，找出了最佳條件，為利用優(yōu)化的發(fā)酵在因素水平，條件指導(dǎo)在發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度發(fā)酵奠定了基礎(chǔ)。由于畢赤酵母高密度發(fā)酵所采用的補(bǔ)料策略除上述已優(yōu)化的參數(shù)外還可對(duì)底物有多種模式，（甘油和甲醇）的流加速率、流加時(shí)機(jī)、流加方式以及外加營(yíng)養(yǎng)物的添加等進(jìn)行優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)重組人源膠原蛋白的高表達(dá)。參考文獻(xiàn)：圖4殘差的正態(tài)概率圖［1］YoungS，WongM，TabataY，etal．Gelatinasadeliveryvehicleforthecontrolledreleaofbioactivemoleculars［J］．JournalofControlledRelea，2005，109（1）：256－274．［2］LandoulsiJ，RoyCJ，Dupont-GillainC，etal．Synthesisofcollagennanotubeswithhighlyregulardimensionsthroughmembrane-templatedlayer-by-layerasmbly［J］．Biomacromolecules，2009，10（5）：1021－1024．［3］GimenezB，TurnayJ，LizarbeMA，etal．Uoflacticacidforextractionoffishskingelatin［J］．FoodHydro-colloids，2005，19（6）：941－950．［4］HeLirong，MuChangdao，ShiJiabo．Modificationofcol-lagenwithanaturalcross-linker，procyanidin［J］．Inter-nationalJournalofBiologicalMacromolecules，2011，48：354－359．［5］TakahiroAdachiT，WangXB，MurataT，etal．Productionofanon-triplehelicalcollagenachainintransgenicsilk-wormsanditvaluationasagelatinsubstituteforcellculture［J］．BiotechnologyandBioengineering，2010，106（6）：860－870．［6］ZhangC，BaezJ，GlatzCE．Purifcationandcharacteriza-tionofa44－kDarecombinantcollagenⅠα1fragmentfromcorngrain［J］．JournalofAgriculturalFoodChemis-2009，57：880－887．try，［7］BuechterDD，PaolellaDN，LelieBS，etal．Co-trans-lationalincorporationoftrans－4－h(huán)ydroxyprolineintoJ］．TheJournalofBi-recombinantproteinsinbacteria［ologicalChemistry，2003，278（1）：645－650．［8］高力虎，楊樹林，儲(chǔ)衛(wèi)華，等．類人膠原蛋白表達(dá)載．南京理工大體的構(gòu)建及在畢赤酵母中的表達(dá)［J］2008，32（2）：252－256．學(xué)學(xué)報(bào)，［9］RaoKJ，KimCH，RheeSK．StatisticaloptimizationofmediumfortheproductionofrecombinanthirudinfromSaccharomycescerevisiaeusingresponsurfacemetho-dology［J］．ProcessBiochemistry，2000，35（7）：639－647．［10］JoglekarAM，MayAT．Productexcellencethroughde-signofexperiments［J］．CerealFoodsWorld，1987，32（12）：857－868．由圖4觀測(cè)值（重組人源膠原蛋白表達(dá)量）殘差的正態(tài)概率圖可以看出，圖像總體呈一直線，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)異常值的存在，說(shuō)明潛在的誤差分布是近似正態(tài)的。圖5殘差與預(yù)測(cè)值的關(guān)系圖說(shuō)明未顯現(xiàn)出任何明顯的模式及異常的結(jié)構(gòu)，證實(shí)了模型的正確性。圖5殘差與預(yù)測(cè)值的關(guān)系圖2．5優(yōu)化驗(yàn)證為驗(yàn)證上述優(yōu)化結(jié)果，按照確定的最優(yōu)條件，實(shí)際取初始誘導(dǎo)pH值為5．0，誘導(dǎo)溫度為28℃，甲醇添加量為2．2%/24h，進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)，重復(fù)試驗(yàn)3次，重組人源膠原蛋白表達(dá)量的實(shí)測(cè)平均值為29．63mg/L，與模型的預(yù)測(cè)值29．87mg/L較為接近，進(jìn)一步說(shuō)明此回歸模型的擬合程度較好。3結(jié)論外源基因在巴氏畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中的高效表達(dá)，除受目的基因本身影響之外，外界環(huán)境因素pH、同樣不可忽視，如培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基成分、通氣量、蛋白酶的降解、甲醇誘導(dǎo)的濃度和誘導(dǎo)時(shí)間等。因此選擇合適的發(fā)酵條件，可有效提高表達(dá)產(chǎn)物得率，降低生產(chǎn)成本。實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)曲面法Behnken設(shè)計(jì)建立了主要因素影響重組中的Box-人源膠原蛋白表達(dá)量的二次回歸模型，并利用統(tǒng)

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