藍白斑篩選原理

2023年12月4日發(作者：悲莫悲兮生別離)

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藍白斑篩選原理

藍白斑篩選的原理 分類:生物科學藍白斑篩選是重組子篩選的一種方法： 是根據載體的遺傳特征篩選重組子，如α-互補、抗生素基因等。現在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的DNA的短區段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區中插入了一個多克隆位點（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。因此，宿主和質粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成具有酶學活性的蛋白質。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區段的質粒之間實現了互補，稱為α-互補。由α-互補而產生的LacZ+細菌在誘導劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時產生藍色菌落，因而易于識別。然而，當外源DNA插入到質粒的多克隆位點后，幾乎不可避免地導致無α-互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質粒的細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍白斑篩選。如用藍白斑篩選則經連接產物轉化的鈣化菌平板37℃溫箱倒置培養12-16hr后，有重組質粒的細菌形成白色菌落。X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷)

pET 載體中，目標基因克隆到 T7 噬菌體強轉錄和翻譯信號控制之下，并通過在宿主細胞提供

T7 RNA 聚合酶來誘導表達。 Novagen 的 pET 系統不斷擴大，提供了用于表達的新技術和選擇，目前共包括 36 種載體類型、 15 種不同宿主菌和設計用于有效檢測和純化目標蛋白的許多其它相關產品。

優點

· 是原核蛋白表達引用最多的系統;· 在任何大腸桿菌表達系統中，基礎表達水平最低;

· 真正的調節表達水平的“變阻器”控制;· 提供各種不同融合標簽和表達系統配置

· 可溶性蛋白生產、二硫鍵形成、蛋白外運和多肽生產等專用載體和宿主菌

· 許多載體以 LIC 載體試劑盒提供，用于迅速定向克隆 PCR 產物

· 許多宿主菌株以感受態細胞形式提供，可立即用于轉化

pET 系統概述

pET 系統是在大腸桿菌中克隆和表達重組蛋白的最強大系統。根據最初由 Studier 等開發的 T7

啟動子驅動系統， Novagen 的 pET 系統已用于表達成千上萬種不同蛋白。

控制基礎表達水平

宿主菌株

質粒在非表達宿主菌中構建完成后，通常轉化到一個帶有 T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（ λ DE3

溶原菌）中表達目標蛋白。在 λ DE3 溶原菌中， T7 RNA 聚合酶基因由 lacUV5 啟動子控制。未誘導時便有一定程度轉錄，因此適合于表達其產物對宿主細胞生長無毒害作用的一些基因。而宿主菌帶有 pLysS 和 pLyE 時調控會更嚴緊。 pLys 質粒編碼 T7 溶菌酶，它是 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未誘導細胞中轉錄目標基因的能力。 pLysS 宿主菌產生低量 T7 溶菌酶，而 pLysE 宿主菌產生更多酶，因此是最嚴緊控制的 λ DE3 溶原菌。

有 11 種不同DE3 溶原化宿主菌。使用最廣泛的為 BL21 及其衍生菌株，它的優點在于缺失 lon

和 ompT 蛋白酶。 B834 菌株為甲硫氨酸營養缺陷型，因此可用 35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸對目標蛋白進行高特異活性標記。 BLR 為 recA - 衍生菌株，改善了質粒單體產量，有助于穩定含有重復序列的目標質粒。兩個硫氧還蛋白還原酶 ( trxB ) 突變菌株 (AD494,BL21 trxB ) ，有利于大腸桿菌胞漿中二硫鍵形成。 Origami TM 和 OrigamiB 菌株為 trxB/gor 雙突變，這兩個酶是主要還原途徑的關鍵酶。 Origami 和 OrigamiB 宿主菌的主要優點是能形成正確折迭的含有二硫鍵的蛋白。新的 Rotta TM 菌株補充了四種大腸桿菌稀有密碼子的 tRNA ，改善了由于密碼子使用頻率不同而引起的一些真核蛋白低表達。其它菌株背景包括 K-12 菌株 HMS174 和 NovaBlue ，象 BLR 一樣為 recA - 。這些菌株可穩定表達其產物可能導致 DE3

噬菌體丟失的某些目標基因。由于存在 F 附加體編碼的高親和力 lacIq 阻遏蛋白， NovaBlue

為一個有用的嚴緊型宿主菌。此外， Novagen 提供了 λ DE3 溶原化試劑盒，用于制備其它遺傳背景的新表達宿主菌。表達高毒性基因或制備新的 λ DE3 溶原菌的另一替代方法是通過 l

CE6 感染提供 T7 RNA 聚合酶。雖然不如用 IPTG 誘導 λ DE3 溶原菌方便，這種策略也被優先用于一些應用中。

高嚴緊性 T7 lac 啟動子

除了在宿主菌水平選擇三種基本的表達嚴緊性， pET 系統中 T7 啟動子本身提供了兩種不同的嚴緊性選擇：普通 T7 啟動子和 T7 lac 啟動子。 T7 lac 啟動子在啟動子區下游 17bp 處含有一個 25bp 的 lac 操縱序列。該位點結合 lac 阻遏蛋白能夠有效降低 T7 RNA 聚合酶的轉錄，這樣提供了在 λ DE3 溶原菌中抑制基礎表達的第二種基于 lacI 的機制（除了抑制 lacUV5 ）。含 T7 lac 啟動子的 pET 質粒還具有它們自己的 lacI ，確保足夠的阻遏蛋白結合到操縱基因位點上。

控制誘導的表達水平

在許多情況下，表達活性可溶性最好的蛋白依賴于宿主細胞的背景、培養條件和合適的載體配置。通常，目標蛋白活性最高的條件與產量最高的條件不一致。除了根據載體 / 宿主菌組合控制 T7

RNA 聚合酶的基礎表達提供不同嚴緊性， pET 系統還根據誘導物（ IPTG ）濃度，對目標蛋白表達提供了真正的“變阻器”控制。 Tuner 和 OrigamiB 宿主菌的 lacY 突變使這種控制成為可能。

PPT180 pSUGV4 大腸桿菌到枯草桿菌之間的克隆載體。pYES-DEST52 invitrogen公司生產的，用于大腸桿菌到釀酒酵母之間的克隆載體，其中有乳清酸核苷-5-磷酸脫羧酶基因(URA3基因)，在缺乏尿嘧啶的選擇性培養基上可以生長。pBPV-BV1由大腸桿菌質粒載體和牛乳頭瘤病毒構建而成的。既可在大腸桿菌細胞中復制，也可在動物細胞中復制，每個細胞平均擁有10-30個拷貝。

pPIC9K

(1)具有醇氧化酶AOX1基因啟動子，這是目前最強，調控機理最嚴格的啟動子之一；

(2)表達效率高,其表達的外源蛋白可占總表達蛋白的90%以上,有利于目的蛋白的分離純化；

(3)在簡單合成培養基中可實現高密度培養； (4)表達質粒能在基因組的特定位點以單拷貝或多拷貝的形式穩定整合； (5)由于該酵母可以以甲醇為唯一碳源和能源,而絕大多數微生物并不能以甲醇為碳源,可以減少污染。

典型的巴斯德畢赤酵母表達載體載體包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的啟動子和轉錄終止子（5'AOX1和3'AOX1），它們被多克隆位點（MCS）分開，外源基因可以在此插入。此載體還包含組氨醇脫氫酶基因（HIS4）選擇標記及3'AOX1區。當整合型載體轉化受體時，它的5'AOX1和3'AOX1能與染色體上的同源基因重組，從而使整個載體連同外源基因插入到受體染色體上，外源基因在5'AOX1啟動子控制下表達。畢赤酵母本身不分泌內源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引導分泌的信號序列。

而由89個氨基酸組成的釀酒酵母的分泌信號—α交配因子(α-factor)引導序列已經成功地引導了幾種外源蛋白的分泌。分泌表達載體主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。胞內表達載體主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，

pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。

畢赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71兩種，都具有HIS4營養缺陷標記。其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位點彼ARG4基因插入，表型為Muts，即甲醇利用緩慢型，兩種菌株都適用于一般的酵母轉化方法. eastern blot:電驅動轉移等電聚焦電泳后的蛋白區帶

biotting歷史如下(來自電泳的原理應用及進展):

轉印電泳最先是由Southern于1975年發明的。在電流作用下，他成功地將DNA片段從瓊脂糖凝膠中轉印到硝酸纖維膜上進行分子雜交分析，因此稱為Southern-blotting。后來，Alwine用類似方法也成功地將RNA從電泳膠中轉印到硝酸纖維膜上作分子雜交分析，但他并沒有稱這一技術為Alwine-blotting，而是稱之為Northern-blotting，以便與Sourhern blotting相對應。1981年Burette又成功地將SDS-PAGE膠中的蛋白質轉印到膜上進行免疫學分析（如抗原抗體結合、蛋白質與配基結合等），繼之Alwine，Burette稱這一技術為Western-blotting。這樣一來，在轉印電泳這個家族中，就有了Southernblotting，Northern-blotting和Western-blotting，僅僅缺一個Eastern-blotting。其實后來有人提議將IEF膠(即等電聚焦電泳)中的蛋白質轉印到膜上的技術稱為Eastern-blotting，但這一建議并未被廣泛接受

Glutathione S-transfera (GST) 谷胱甘肽巰基轉移酶

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