谷氨酰胺轉氨酶在Pichia pastoris GS115中的表達及其發酵條件響應面法優

2023年12月4日發(作者：調任通知)

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第43卷第6期2020年11月河北農業大學學報JOURNAL OF HEBEI AGRICULTURAL UNIVERSITYVol.43 No.6Nov.2020文章編號：1000-1573(2020)06-0083-07DOI：10.13320/.2020.0116谷氨酰胺轉氨酶在Pichia pastoris GS115中的表達及其發酵條件響應面法優化于?凡1，劉?雙1，陳海清1，王紅靜1，馬?雯1，石?楠2，檀建新1（1. 河北農業大學 食品科技學院，河北 保定 071001；2. 河北大學 生命科學學院/河北省微生物多樣性研究與應用重點實驗室，河北 保定 071002）摘要：為了將篩選得到的吸水鏈霉菌107.3的谷氨酰胺轉氨酶基因在畢赤酵母GS115中表達，并通過優化發酵條件來提高重組菌株酶的表達量，本試驗構建了由吸水鏈霉菌前肽pro、kex2酶切位點、成熟酶mTGa 3部分組成的融合基因，電轉至畢赤酵母GS115中進行表達；采用Plackett-Burman（PB）設計和響應面法（RSM）在搖瓶水平研究了重組畢赤酵母的發酵條件（接種量、誘導溫度和時間、初始pH值和甲醇濃度）。結果表明：吸水鏈霉菌的TGa基因在畢赤酵母GS115中得獲得成功表達，酶活力為0.3 U/mL；通過PB試驗設計確定了影響產酶的顯著性因素為誘導初始pH、甲醇濃度和接種量。進一步選擇該3個顯著因素進行RSM中心組合試驗，確定了最優的產酶條件為：接種量OD600為6、pH 7、甲醇濃度2.0%、誘導溫度23 ℃、誘導時間72 h。優化發酵條件后，重組菌株產TGa酶活力可達1.1 U/mL，是初始酶活的3.6倍。本研究構建的MTG異源表達體系為MTG生產和分子改造提供了平臺。關?鍵?詞：谷氨酰胺轉氨酶；畢赤酵母；Plackett-Burman（PB）設計；響應面法；吸水鏈霉菌中圖分類號：Q786

文獻標志碼：A開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：Expression of transglutamina in Pichia pastoris GS115 and optimization

of its fermentation conditions using respon surface methodologyYU?Fan1,?LIU?Shuang1,?CHEN?Haiqing1,?WANG?Hongjing1,?MA?Wen1,??SHI?Nan2,?TAN?Jianxin1（1. College of Food Science and Technology, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, China；2. School of

Life Sciences/Key Laboratory of Microbial Diversity Rearch and Application of Hebei Province, Hebei University,

Baoding 071002, China）Abstract：In order to express the transglutamina (TGa) gene of Streptomyces hygroscopicus 107.3 in Pichia

pastoris GS115 and improve the expression of recombinant enzyme by optimizing fermentation conditions, a fusion

gene containing TGa propeptide (pro),

kex2 protea cutting site and mature TGa (mTGa) of S. hygroscopicus

was constructed in this experiment and transferred to P. pastoris GS115 for expression. Plackett Burman (PB) design

and respon surface methodology (RSM) were ud to study the expression conditions (inoculum size, induction

收稿日期：2020-08-21基金項目：?河北省重點研發計劃項目（16275505D）；河北省食品科學與工程學科“雙一流”建設資金項目（2016SPGCA18）.第一作者：于 凡(1994-)，男，河北保定人，碩士研究生，從事食品工程方向的研究.通信作者：檀建新(1968-)，男，河北唐山人，博士，教授，從事食品生物技術研究. E-mail:*******************石 楠(1977-)，女，河北保定人，博士，副教授，從事微生物學研究. E-mail:***************本刊網址：http: // hauxb. hebau. edu. cn: 8080 /CN/ volumn / home. shtml84河北農業大學學報第43卷temperature and time, initial pH value and methanol concentration) at a level of cultivation in shake flask. The

results indicated that the TGa gene of S. hygroscopicus was successfully expresd in P. pastoris GS115, and the

enzyme activity was 0.3 U/mL. Three significant factors including initial pH, methanol concentration and inoculation

amount, which affected the enzyme production, were screened out by PB design and further subjected to RSM Box-Benhnken test to determine the optimal enzyme production conditions. The results showed that the optimal conditions

for a production were as follows: inoculum OD600=6, pH=7, methanol concentration 2.0%, induction temperature 23

℃and induction time 72 h. After optimizing the fermentation conditions, the TGa activity of the recombinant strain

was up to 1.1 U/mL, which was 3.6 times of the initial enzyme activity. The heterologous expression system of MTG

constructed in this study provides a platform for MTG production and molecular ds: transglutamina; Pichia pastoris; Plackett-Burman (PB) design; respon surface methodology;

Streptomyces hygroscopicus谷氨酰胺轉氨酶（Transglutamina，縮寫為TGa，EC 2.3.13）是一種重要的食品酶［1］，具有催化酰基轉移、脫酰胺和蛋白質分子間或分子內的賴氨酸與谷氨酰胺共價交聯的活性［2］。后者可以改變蛋白質網絡結構、增強保水能力和促進凝膠形成，提高蛋白質營養價值［3］。因此，被廣泛應用于蛋白質的修飾，從而改善蛋白質的理化性質和功能［4］，在食品、醫藥、紡織等領域具有重要的應用價值［5］。TGa在自然界中分布廣泛，包括豚鼠肝臟、植物以及微生物［6］。微生物來源的谷氨酰胺轉氨酶又稱為MTG（Microbial transglutamina），與動植物來源的TGa相比，MTG具有分子量小、Ca2+獨立性、較高的反應速率和熱穩定性以及較寬的酰基供體底物專一性等優點，更適合工業生產和應用［4］。同時，因為微生物生長快，產量大，效率高，所以達到工業規模的用于食品改性的商業化MTG都是由微生物發酵生產的［7］。然而，MTG也存在一些缺點，如天然宿主鏈霉菌的發酵培養基相對昂貴，發酵工藝復雜，增加了大規模生產的成本和復雜程度［8］。因此，異源重組表達則成為生產MTG的一種可行的技術手段［9］。巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）表達系統已被廣泛用于外源重組蛋白質的表達，可同時生產分泌蛋白和細胞內蛋白［10］。目前，已有500多種來自哺乳動物、植物、酵母和細菌的外源蛋白在畢赤酵母中獲得了成功表達［11］。畢赤酵母具有操作簡單、生物量和蛋白產量高的優點，并且它是甲醇營養型酵母，具有強啟動子AOX1，可嚴格調控和驅動高水平的蛋白表達，能夠進行蛋白質水解、折疊、二硫鍵形成和糖基化等翻譯后修飾。這些特點使畢赤酵母成為大規模生產重組酶的理想宿主［12］。許多在原核系統中以非活性形式表達的蛋白質在畢赤酵母中都實現了活性形式的表達［13］。利用畢赤酵母高效表達外源蛋白的特性，本研究將含有吸水鏈霉菌TGa基因的pPIC9K-pro-kex-TGa重組分泌表達載體在畢赤酵母GS115中表達，并通過Plackett-Burman（PB）設計和響應面法Respon surface methodology（RSM）評價并優化了TGa的發酵條件，以期為后續大規模發酵提供參考。1?材料與方法1.1?材料1.1.1?菌株及質粒?巴斯德畢赤酵母GS115及pPIC9K空載質粒由本實驗室保存；吸水鏈霉菌TGa基因克隆來自本實驗室保存的吸水鏈霉菌

（Streptomyces hygroscopicus）菌株107.3，pPIC9K-

pro-kex-TGa由本實驗室前期構建保存。1.1.2?培養基及試劑?參考Invitrogen畢赤酵母表達手冊，配制YPD培養基、MD培養基、生長培養基BMGY、誘導培養基BMMY。DH5α感受態、

SolutionⅠ購自北京博邁德基因技術有限公司；SalⅠ等酶購自大連寶生物公司；PCR Mix、Super

Marker（100-10 kb）、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；引物合成及測序由通用生物系統（安徽）有限公司完成。1.1.3?儀器與設備?SPX-250B-Z型生化培養箱，上海博迅公司； H-1850R臺式高速冷凍離心機，長沙湘儀公司；PCR儀德國Biometra公司；756P紫外可見分光光度計，上海光譜公司；Gene Pulr Xcell第6期 于 凡,等：谷氨酰胺轉氨酶在Pichia pastoris GS115中的表達及其發酵條件響應面法優化85電穿孔儀，美國Bio-Rad公司。1.2?試驗方法1.2.1?重組畢赤酵母GS115的構建?取-80 ℃保存含pPIC9K-pro-kex-TGa重組載體的大腸桿菌甘油保藏管，按1%接種量接種于5 mL含0.1%（v/v）氨芐抗性的LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min培養過夜，收集菌體并使用質粒提取試劑盒提取質粒。用salⅠ酶切處理重組質粒pPIC9K-pro-kex-TGa使之線性化，再電轉化至GS115感受態細胞內并整合到基因組中，利用菌落PCR及酶活性比色法對轉化子進行篩選，獲得陽性轉化子。1.2.2?重組GS115/pPIC9K-pro-kex-TGa搖瓶培養基誘導表達?挑取陽性轉化子GS115/pPIC9K-pro-kex-TGa，活化后按1%接種量接種于含25 mL

BMGY生長培養基的250 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min培養25 h。參照畢赤酵母表達手冊方法，4 ℃、5 000 r/min收集菌體并轉接到BMMY誘導培養基中，23 ℃、200 r/min繼續培養72 h，每24 h補加100%甲醇至終濃度0.5%。取誘導結束后的發酵液，12 000 r/min離心10 min收集上清液，即為粗酶液。1.2.3?酶活測定及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳?酶活測定使用經典氧肟酸比色法［14］，取50 μL粗酶液置于1.5 mL離心管中，加入50 μL

A液（CBZ、鹽酸羥胺、GSH、0.2 mol/L Tris-HAc）混和均勻，放入37 ℃水浴鍋溫浴10 min，加

50 μL B液（3 mol/L HCL、5% FeCl3、CCL3COOH）終止反應并顯色。反應體系經12 000 r/min離心1 min

后，取100 μL轉入96孔酶標板中，在525 nm波長下測定上清液的吸光值；另取50 μL粗酶液煮沸滅活，其余步驟同上，作為對照用于樣品測定吸光度值時調零。dispaⅡ處理粗酶液在37 ℃水浴鍋溫浴20 min［15］。根據L-谷氨酸-γ-單羥肟酸標準曲線，y

=

0.031

8x+0.042 4（x為L-谷氨酸-γ-單羥肟酸濃

度mmol/L，y為OD525下的吸光值A，R2=0.999

8），

計算酶活力值。酶活單位定義為37 ℃下每分鐘催化形成1 μmol的L-谷氨酸-γ-單羥肟酸所需要的酶量。使用12%分離膠對酶提取液進行SDS-PAGE凝膠電泳分析［16］。1.3?數據統計分析數據統計分析旨在尋找顯著變量及其與實驗結果的關系，以便對變量水平進行管理以獲得期望的結果輸出［17］。因此根據TGa酶活力的實驗結果，分析了TGa酶活力和誘導表達發酵參數的關系，通過Design-Expert V8.0.6專業實驗設計軟件，設計實驗方案、進行分析和預測。1.3.1?Plackett-Burman（PB）設計?PB設計［18］可

以快速、有效的從本試驗的多個發酵條件中篩選出主要因素。根據前期單因素預實驗結果，采用PB設計對接種密度、溫度、初始pH、甲醇濃度、誘導時間共5個因素對TGa生產的影響進行研究，試驗次數N=12，每個因素選取高低兩個水平（表1）。表1?PB設計的因素和水平Table 1?Factors and levels of PB design編碼因子水平-1+1X1接種密度OD60016X2誘導溫度/℃2030X3初始pH56.5X4甲醇濃度/%0.52X5誘導時間/h48721.3.2?Box-Behnken設計（BBD）和響應面方法（RSM）在PB設計結果的基礎上，通過RSM進一步優化具有顯著影響的因素。通過Box-Behnken設計3因素2水平的響應面試驗，再以粗酶液的酶活為響應值。使用二次多項式模型來探索顯著因素變量和響應變量之間的關系。最終目標是通過建模和分析影響響應值的多個獨立變量來優化發酵參數［19］。數學模型如下：Y=α0+ΣαiXi+ΣαijXiXj+ΣαiiX2i （1）Y是預測響應值，α0為常數項，αi為因子影響系數，αij為因子間交互響應系數，αii為二階影響系數因子。Xi

Xj自變量的水平。2?結果與分析2.1?重組畢赤酵母GS115/pPIC9K-pro-kex-TGa?誘導表達及SDS-PAGE分析將構建并篩選出的陽性轉化子菌株進行誘導表達后收集粗酶液進行酶活檢測，粗酶液可直接檢測86河北農業大學學報第43卷出較低的酶活性，說明粗酶液中含有正確折疊且有活性的成熟酶TGa（mTGa），推測可能是由于GS115菌株自身的kex2酶識別Lys-Arg位點并對酶原pro-kex-TGa酶切形成了mTGa所致。粗酶液經dispaⅡ處理后酶活力達到（0.314±0.002）U/mL，

而GS115空白菌株、GS115/pPIC9K空載菌株在相同條件下發酵上清液中沒有檢測到MTG酶活，說明兩者不表達TGa，而含有酶原pro-kex-TGa基因的陽性轉化子菌株能夠很好地表達酶原且具有TGa活性。對收集的粗酶液進行SDS-PAGE電泳分析，結果見（圖1）。泳道1、2分別是GS115、GS115/pPIC9K發酵上清液，未見蛋白條帶，說明GS115、GS115/pPIC9K本身不表達TGa酶蛋白；泳道3為GS115/pPIC9K-pro-kex-TGa發酵上清液，在約45 kD處出現明顯蛋白條帶，這與S. hygroscopicus谷氨酰胺轉氨酶酶原的蛋白分子理論大小基本一致，說明TGa獲得了很好地表達且不存在糖基化修飾。然而，在胞外粗酶液中直接檢測到了TGa酶活力，說明該表達系統也直接生成了分泌到胞外的折疊正確的mTGa，理論上其分子大小約為38 kD，但在SDS-PAGE圖中只有1條45 kD的TGa酶原條帶（圖1），說明可能只有很少的酶原經過kex2酶活化成mTGa，故在SDS-PAGE膠圖中未出現相應條帶。M 1 2 375 kD55 kD45 kD40 kD注：M：PageRuler預染色標準蛋白；1：GS115發酵上清液；

2：GS115/pPIC9K發酵上清液；3：GS115/pPIC9K-pro-kex-TGa發酵上清液。圖1?TGa粗酶液的SDS-PAGE電泳分析Fig. 1?SDS-PAGE electrophoresis analysis of TGa crude

enzyme solution2.2?用PB設計篩選TGa表達的主要因素所有試驗除研究因素外其它條件均保持一致，PB實驗設計與結果見表2。表2?PB實驗設計與結果Table 2?PB experimental design and results序號因素 FactorNo.X1X2X3X4X5Y/ (U·mL-1)111-1-1-10.1902-1111-10.448311-1110.3444-1-1-11-10.26951-1-1-110.3196-1-1-1-1-10.2317-11-1110.25681-11110.8109111-1-10.40110-1-11-110.426111-111-10.58012-111-110.306確定顯著性因素并進行方差分析（見表3）。“Prob

＞

F”（P值）值表明模型和因子的顯著性水平。“Prob＞F”值小于0.050

0表示顯著，大于0.100

0表示不重要。PB結果分析5個因素對TGa的生產影響，按重要性排序為：X3＞X4＞X1＞X2＞X5。其中X3、X4對TGa酶活力有顯著影響（P＜0.01），選擇X3、X4和X1（誘導pH、甲醇濃度、接種密度）進一步優化。表3?PB設計結果分析Table 3?Analysis of PB design resultsFactor因素FF value值Prob ＞

F（P value）Importance重要性X110.110.019 13X29.600.021 24X337.410.000 91X414.030.009 62X52.360.175 552.3?用RSM優化顯著因子2.3.1?RSM試驗設計?使用響應面中的BBD法對顯著因子編碼，誘導起始pH（A）、甲醇濃度（B）和誘導起始接種密度（C）進行優化試驗，研究3個因子的相互作用和最佳水平。獲得多元二次方程如下所示：Y=0.82+0.13*A-0.053*B+0.032*C+0.015*AB+

0.012*AC-(7.000E-003)*BC-0.062*A2-0.24*B2-0.059*C2 （2）Y為預測TGa酶活力，A、B和C分別為3個顯著因子的編碼值。每個因子有3個編碼水平（1，0，-1），共進行了17次運行。響應面試驗設計見表4。第6期 于 凡,等：谷氨酰胺轉氨酶在Pichia pastoris GS115中的表達及其發酵條件響應面法優化表4?響應面試驗設計Table 4?Experimental design of respon surface編號No.17A pH6.506.507.006.006.506.006.006.507.006.506.507.006.006.506.506.507.00B甲醇濃度/%Methanol

concentration2.002.002.002.502.501.502.002.001.502.501.502.502.002.002.001.502.00C接種密度/AVaccination

density6.006.008.006.008.006.004.006.006.004.004.006.008.006.006.008.004.00粗酶活/（U·mL-1）Crude enzyme activity0.8060.8140.8790.3300.5100.4820.5390.8520.6750.4430.5170.5830.5620.7890.8220.6120.806872.3.2?回歸分析?對該方程2.3.1（2）進行回歸系數顯著性檢測和方差分析。表5結果表明，模型F值為61.69意味著該模型具有顯著性，只有0.01%的可能性，因為噪音而產生較大的“F值”。“P值”即小于0.050

0表示模型項是有效的，在這種情況下，A、B、C、A2、B2、C2是重要的因子項。大于0.100

0的值表示因子項不重要，AB、AC、BC不重要。失擬項為2.16.意味著缺乏擬合相對于純誤差不顯著，有23.55%的可能性出現這樣大的失擬值是由于噪聲。對可信度進行分析，模型R2=0.987

5，變異系數（C.V. %）為4.3，說明模型的擬合程度和可信度較高。“Adeq

Precision”測量信噪比，比率大于4是所期望的。該模型25.987的比率表明信號充足。說明此模型可用于模擬TGa酶活力的理論預測。表5?響應面二次模型的方差分析Table 5?ANOVA of the quadratic model of respon surface方差來源Source模型A-pHB-甲醇濃度C-接種密度ABACBCA2B2C2殘差失擬項純誤差總和平方和Sum of square0.450.130.0228.321E-0039.000E-0046.250E-0041.960E-0040.0160.240.0145.666E-0033.503E-0032.163E-0030.46自由度Degree of freedom9416均方Mean square0.0500.130.0228.321E-0039.000E-0046.250E-0041.960E-0040.0160.240.0148.095E-0041.168E-0035.408E-0042.160.235 5not significantF 值F value61.69163.8327.2410.281.110.770.2419.71293.5317.83P 值P value＜ 0.000 1＜ 0.000 10.001 20.014 90.326 70.408 70.637 70.003 0＜ 0.000 10.003 9顯著性Significancesignificant注：R=0.993 7，R2=0.987 5，R2（adjust）=0.971 5，coefficient of variation（CV）=4.3%，Adeq Precision=25.142。2.3.3?響應面各因子相互作用的關系?為了更好地理解各因子對TGa生產的影響，使用Design-Expert.V8.0.6獲得了各因子的2D等高線圖和3D響應曲面（見圖2～4）。通過響應曲面和等高線圖直觀地觀察到AB，AC和BC之間相互作用。等高線圖呈橢圓時，表示兩因子間具有顯著的交互作用，其它則不顯著。圖2（b）圖4（b）的曲面較陡，說明pH和甲醇濃度、甲醇濃度和接種密度的交互作用對酶活性影響較顯著。圖3（b）曲面較平緩，說明pH和接種密度的交互作用對酶活性影響不顯著。圖2（a）圖4（a）的等高線趨向橢圓形，說明pH和甲醇濃度、甲醇濃度和接種密度的交互作用明顯。通過沿輪廓的長軸和短軸移動來獲得變量的統計最優值。在等高線圖中最小的橢圓中得到最高的預測值。預測最佳發酵條件：誘導初始pH 7，甲醇濃度2.07%，接種密度OD600 6.27，預測響應值為1 U/mL。88河北農業大學學報第43卷ab圖2?誘導pH值和甲醇濃度影響酶活力的等高線a和響應面曲圖bFig. 2?The contour a and respon surface plot b of induced pH and methanol concentration affecting enzyme activityab圖3?誘導pH值和接種密度影響酶活力的等高線a和響應曲面bFig. 3?The contour a and respon surface b of induced pH density affecting enzyme activityab圖4?甲醇濃度和接種密度影響酶活力的等高線a和響應曲面bFig. 4?Contour a and respon surface b of methanol concentration and inoculation density affecting enzyme activity2.3.4?發酵條件的優化驗證?經響應面優化，結合實際情況調整最佳誘導條件為誘導接種密度OD600為6，pH為7，甲醇濃度為2.0%，溫度23 ℃，誘導時間72 h，進行3組平行發酵試驗，在此條件下獲得的粗酶液經dispaⅡ處理，檢測到TGa酶活力為（1.03±0.075 ）U/mL；與響應面優化設計所得預測值相近，證明該模型較好的預測了試驗結果。3?討論與結論到目前為止，人們嘗試了不同來源的TGa在P. 第6期 于 凡,等：谷氨酰胺轉氨酶在Pichia pastoris GS115中的表達及其發酵條件響應面法優化89pastoris中的表達，但酶活力普遍不高，例如2019年，Yang等［20］試驗表明，表達弗氏鏈霉菌TGa酶活力達到0.7 U/mL，且證明TGa活性能夠引起于豬肉、雞肉和大豆蛋白的交聯重構。2019年Li等［13］研究表明，表達玉米TGa獲得可溶性TGa酶活力達到0.889 U/mg。而來源于S. hygroscopicus 的TGa的在酵母中異源表達研究較少，萬丹研究報道的重組吸水鏈霉菌TGa在解脂耶氏酵母中表達酶活力為1.06 U/mL［15］。P. pastoris作為應用最廣泛的真核表達系統，對MTG的大量表達還有巨大的發展潛力。本研究構建的重組吸水鏈霉菌TGa的P. pastoris表達系統，既可以產生大量酶原蛋白，又可以直接產生具有酶活性的mTGa，其原因可能是GS115菌株自身的kex2蛋白酶識別KR位點并酶切了表達的TGa酶原形成了有活性的mTGa，這在一定程度上實現了本研究的設計目標。Bader et

al［21］研究發現，畢赤酵母可產生kex2蛋白酶，該酶的存在為mTGa形成提供了可能性。但在發酵條件優化前后，SDS-PAGE電泳中均未出現明顯的mTGa蛋白條帶，說明優化前后被kex2酶活化的TGa酶原仍然只是一小部分，還有很大的改造潛力。目前關于提高畢赤酵母TGa表達量的方法，報道較多是啟動子改造、信號肽替換、高拷貝菌株篩選等［22］，該重組表達系統未來可以通過共表達kex2酶、使用專一性切割TGa酶原區的TAMEP蛋白酶、發酵培養基優化等方法來獲得更高的酶活力，有助于其工業化應用。本研究經過Plackett-Burman（PB）和Box-Behnken（RSM）試驗設計優化發酵條件，結果表明優化后獲得的TGa酶活力比未優化發酵條件前提高了近3.6倍，說明將PB設計和RSM試驗方法相結合，用于篩選顯著影響因子并揭示因子間的相互關系的優化方法可行，Yu et al［19］曾使用該方法優化生產胞外溶菌酶的發酵條件，使該酶得到了高效表達。本研究構建了表達吸水鏈霉菌TGa的重組畢赤酵母菌株GS115/pPIC9K-pro-kex-TGa，在接種密度OD600為6，pH為7，甲醇誘導濃度為2.0%，溫度23 ℃，誘導時間72 h的優化條件下，TGa最大酶活力達到1.1 U/mL，并實現了有活性mTGa的胞外分泌表達，為MTG生產和分子改造提供了新思路。參考文獻：［1］ Duarte L S，Bar L Q，Dalberto P F，et al. Cloning

and expression of the

Bacillus

amyloliquefaciens

transglutamina gene in

E. coli using a bicistronic

vector construction［J］. Enzyme Microb Technol，2020，134: 109468.［2］ Yokoyama K，Nio N，Kikuchi Y. Properties and

applications of microbial transglutamina［J］. Appl

Microbiol Biotechnol，2004，64(4): 447-454.［3］ Grossmann L，Wefers D，Bunzel M，et al.

Accessibility of transglutamina to induce protein

crosslinking in gelled food matrices - Influence of

network structure［J］. LWT，2017，75: 271-278.［4］ Miwa N. Innovation in the food industry using

microbial transglutamina: Keys to success and future

prospects［J］. Anal Biochem，2020，597: 113638.［5］ Zhu Y，Tramper J. Novel applications for microbial

transglutamina beyond food processing［J］. Trends

Biotechnol，2008，26(10): 559-565.［6］ Li H，Zhang L，Cui Y，et al. Expression of soluble

recombinant transglutamina from

Zea mays in

Pichia

pastoris［J］. World J Microbiol Biotechnol，2013，29(5): 939-947.［7］ Mostafa H S. Microbial transglutamina: An overview

of recent applications in food and packaging［J］.

Biocatalysis and Biotransformation，2020，38(3):

161-177.［8］ Kieliszek M，Misiewicz A. Microbial transglutamina

and its application in the food industry. A review［J］.

Folia Microbiol (Praha)，2014，59(3): 241-250.［9］ Rickert M，Strop P，Lui V，et al. Production of

soluble and active microbial transglutamina in

Escherichia coli for site-specific antibody drug

conjugation［J］. Protein Sci，2016，25(2): 442-455.［10］ Cos O，Ramon R，Montesinos J L，et al. Operational

strategies, monitoring and control of heterologous

protein production in the methylotrophic yeast

Pichia

pastoris under different promoters: a review［J］.

Microb Cell Fact，2006，5: 17.［11］ 閔兆升，郭會明，顏旭，等. 巴斯德畢赤酵母(is)高密度發酵研究進展［J］. 生物技術通報，2014(3):

42-49.［12］Turkanoglu，Ozcelik A，Ersoz F，Inan M.

Extracellular production of the recombinant bacterial

transglutamina in

Pichia pastoris［J］. Protein Expr

Purif, 2019, 159: 83-90.（下轉第107頁）第6期葛琳涵,等：雞內源性白血病毒ev21與其側翼區SNP位點的連鎖關系DNA, 2020,11(1):22.107［14］ Diep C H, Daniel A R, Mauro L J, et al. Progesterone

action in breast, uterine, and ovarian cancers［J］.

Journal of Molecular Endocrinology, 2015,4(2):31-53.［15］ Student S, Hejmo T, Potera?a-Hejmo A, et al. Anti-androgen hormonal therapy for cancer and other

dias［J］. European Journal of Pharmacology,

2020(866):172783.［16］ Boulliou A, Pennec J P L, Hubert G, et al. The

endogenous retroviral ev21 locus in commercial

chicken lines and its relationship with the slow-feathering phenotype (K)［J］. Poultry Science,

1992,71(1):38-46.

［17］ Wallace A D, Wendt G A, Barcellos L F, et al. To ERV

is human: A phenotype-wide scan linking polymorphic

human endogenous retrovirus-K inrtions to complex

phenotypes［J］. Frontiers in Genetics, 2018(9):1-14.［18］ Mason A S, Lund A R, Hocking P M, et al.

Identification and characterisation of endogenous

Avian Leukosis Virus subgroup E (ALVE) inrtions in

chicken whole genome quencing data［J］. Mobile

［19］ Mousazadeh S, Ghaheri A, Shahhoini M, et al. The

effect of imbalanced progesterone receptor-a/-b ratio

on gelatina expressions in endometriosis［J］. Int J

Fertil Steril, 2019,3(2):127-134.［20］ Daraei A, Izadi P, Khorasani G, et al. Methylation of

progesterone receptor isoform A promoter in normal

breast tissue: An epigenetic link between early age

at menarche and risk of breast cancer?［J］. J Cell

Biochem, 2019,120(8):12393-12401.［21］ Sun X, Wang Y, Ji K, et al. NRF2 prerves genomic

integrity by facilitating ATR activation and G2 cell

cycle arrest［J］. Nucleic Acids Res,2020,48(16):

9109-9123.［22］ Li Z, Chen Y, Li W, et al. Cell division cycle 2

protects neonatal rats against hyperoxia-induced

bronchopulmonary dysplasia［J］. Yoni Med J,

2020,61(8):679-688.（編輯：李?川）（上接第89頁）［13］ Li H，Zhang T，Li J，et al. Expression of Zea mays

transglutamina in

Pichia pastoris under different

promoters and its impact on properties of acidified

milk protein concentrate gel［J］. J Sci Food Agric，2019，99(10): 4518-4523.［14］ 石楠. 微生物谷氨酰胺轉氨酶的發酵與異源表達研究［D］. 保定：河北農業大學，2019.［15］ 萬丹. 吸水鏈霉菌谷氨酰胺轉胺酶在解脂耶氏酵母中的表達及酶學性質研究［D］. 無錫：江南大學，2014.［16］ Lee M C，Wu K S，Nguyen T N，et al. Sodium

dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis for

direct quantitation of protein adsorption［J］. Anal

Biochem，2014，465: 102-104.［17］ 張斯璇，劉瑛，時旭，等. 響應面法優化重組亞油酸異構酶產酶條件［J］. 現代食品科技，2019，35(8):

174-179.［18］ Ahuja S K，Ferreira G M，Moreira A. Application

of Plackett-Burman Design and Respon Surface

Methodology to Achieve Exponential Growth for

Aggregated Shipworm Bacterium［J］. Biotechnology

and Bioengineering，2004，85(6): 666-675.［19］ Yu Y，Zhou X，Wu S，et al. High-yield production

of the human lysozyme by

Pichia pastoris SMD1168

using respon surface methodology and high-cell-density fermentation［J］. Electronic Journal of

Biotechnology，2014，17(6): 311-316.［20］ Yang X，Zhang Y. Expression of recombinant

transglutamina gene in

Pichia pastoris and its us in

restructured meat products［J］. Food Chem，2019，291: 245-252.［21］ Bader O，Krauke Y，Hube B. Processing of predicted

substrates of fungal Kex2 proteinas from

Candida

albicans,

C.

glabrata, Saccharomyces cerevisiae and

Pichia pastoris［J］. Bmc Microbiol，2008，8(1):1-16.［22］ 王彤，徐巖，喻曉蔚. 畢赤酵母Kex2蛋白酶的同源表達及酶學性質［J］. 中國生物工程雜志，2019，39(1): 38-45.（編輯：李?川）

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