豬肺炎支原體MY_99株P(guān)46基因的序列分析

2023年12月22日發(fā)(作者：成長的路上作文)

中國畜牧獸醫(yī)　2010年第37卷第4期生物技術(shù)?103?豬肺炎支原體MY299株P(guān)46基因的序列分析熊丁杰,熊焰,藺露(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,雅安　625014)摘要:提取豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae)MY299株DNA,利用設(shè)計(jì)的一對(duì)引物擴(kuò)增編碼P46蛋白的基因,將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD182T載體,挑取2個(gè)克隆株測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明,P46基因全長1134bp,編碼378個(gè)氨基酸,序列的182、381和734位有3個(gè)TGA,是編碼色氨酸Trp的密碼子。2個(gè)克隆株的測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)株232株的P46基因序列相比,其同源性分別為99.6%和99.2%。關(guān)鍵詞:豬肺炎支原體;P46基因;序列分析中圖分類號(hào):S858.28　　　　　文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A　　　　　文章編號(hào):167127236(203　　豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae,)Mhp)可引起豬支原體肺炎(MPS,又稱“喘氣病”。MPS是一種發(fā)病率高,死亡率低的慢性疾病,單純的豬肺炎支原體感染主要引發(fā)豬的慢性肺炎,當(dāng)該病與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型或豬流感病毒混合感染時(shí)就會(huì)發(fā)生常見的豬呼吸道疾病綜合征(PRDC),對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重破壞(Barbara等,2006)。豬肺炎支原體有3個(gè)主要的體無交叉反應(yīng)(Satoshi等,1995)。本研究旨在分析四川田間分離株MY299與標(biāo)準(zhǔn)株的同源性,為今后利用MY299株研發(fā)診斷用抗原和基因疫苗奠定基礎(chǔ)。1　材料與方法1.1　材料1.1.1　菌株　豬肺炎支原體MY299株由四川農(nóng)業(yè)抗原基因:P97、P101和P46,其中P46基因及編碼的蛋白質(zhì)具有很高的保守性,對(duì)Mhp的診斷具有重要意義,利用在中表達(dá)的豬肺炎支原體J株46ku的表面抗原(P46蛋白),在Mhp發(fā)病早期進(jìn)行ELISA診斷,發(fā)現(xiàn)其與豬的其他支原收稿日期:2009210227作者簡(jiǎn)介:熊丁杰(1984-),男,四川人,碩士生,研究方向:分子病毒學(xué)。通信作者:熊焰(1955-),男。E2mail:xyan2004@基金項(xiàng)目:四川省畜牧食品局資助項(xiàng)目(2004):豬氣喘病病原分子生物學(xué)特性及疫苗研究。大學(xué)動(dòng)醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存(孫霞等,2001);大α購自成都博瑞克有限公司;腸桿菌DH5CompetentCellJM109、pMD182T載體購自大連寶生物公司。1.1.2　試劑　蛋白酶K溶液(20mg/mL)購自Amersco;Goldview購自賽百勝;瓊脂糖Agaro購自Promega。EDTA、Tris、SDS、丙烯酰胺(Acr)、甲叉雙丙烯酰胺(Bis)、過硫酸銨、巰基乙醇和EDTA等均購自生物試劑公司。1.1.3　儀器　離心機(jī)(EppendorfCentrifuge5804R);PCR儀(Eppendorf,Mastercycler);電泳儀(Bio2Rad),電泳槽(Bio2Radmini2subcellGT);紫外iationof155nucleotideallweredetectedincodingandnoncodingre2gionbycomparingJuemapigwithother14breeds,and119outofthemwereinintronregionsand28outofthemwereinexonregions,with104transversions,14commutations,23abnces,ubstitutivesitesofbasicgroup,mostwastransversionmutations;thecomparisionbetweentransversionandcommutationswas7.43∶1,centageanddivergencenumberofJuemapig’sgrowthhormonegenehomologyan2alyshowedthathomologywasnearerbycomparingJuemapigwithotherminitypepig,15kindsanaly,whichindicatedJuemapighavingfardistantgeneticrelationshipwiththeVizepig;JuemapigandRongjiangpig’ds:Juemaswine;growthhormonegene;homology;polymorphism

?104?生物技術(shù)中國畜牧獸醫(yī)　2010年第37卷第4期檢測(cè)儀(北京六一廠,WD29403C型);PCR引物由2.2　P46基因的克隆及重組質(zhì)粒的鑒定　從克隆上海生物工程有限公司合成;測(cè)序由大連寶生物工平板上挑取單個(gè)菌落,以M13247/RV2M為引物進(jìn)程有限公司完成。行PCR擴(kuò)增,出現(xiàn)了1.1kb左右的條帶,挑取其中21.1.4　培養(yǎng)基　豬肺炎支原體培養(yǎng)基按ATCC豬個(gè)陽性菌落命名為CTB56023和CTB56026(圖2)。肺炎支原體培養(yǎng)基配方配制。1.2　方法1.2.1　引物設(shè)計(jì)　利用Oligo6.0引物設(shè)計(jì)軟件,根據(jù)GenBank上豬肺炎支原體國際標(biāo)準(zhǔn)株232株的P46基因和全基因,設(shè)計(jì)出一對(duì)擴(kuò)增P46基因的最佳引物。并分別在上下引物之前加入BamHI和HindIII酶切位點(diǎn),引物由寶生物工程公司合成。上游引物,5′2CGGGATCCACTTCAGATTCTA2AACCACAA23′;下游引物,5′2CGAAGCTTT2TAGGCATCAGGATTATCAACA23′。1.2.2　豬肺炎支原體P46基因的PCR擴(kuò)增　用設(shè)計(jì)的引物對(duì)豬肺炎支原體MY299的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為20μL(10×buffer2μL,2.5mmol/LdNTP0.5μL,上游引物0.5μL,下游引物0.5μL,TaqDNA酶0.5μL,模板1.5μL,3.0mmol/LMgCl23μL,滅菌去離子水11.5μL)。反應(yīng)條件為94℃4min;94℃30s,58℃30s,72℃1min,35個(gè)循環(huán);72℃10min。1.2.3　豬肺炎支原體P46基因與T載體的連接　2.3　P46基因的序列測(cè)定結(jié)果及推導(dǎo)氨基酸序列使用TaKaRaDNAA2TailingKit在擴(kuò)增PCR產(chǎn)分析　測(cè)序結(jié)果表明,克隆的P46基因全長1134物的兩端加A,再將其與pMD2T載體在TaKaRabp,編碼378個(gè)氨基酸,其中3個(gè)TGA是色氨酸的DNALigationkit的solutionI中進(jìn)行連接,連接溫度為16℃。連接產(chǎn)物熱轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌mpetentCellJM109中,涂布平板,過夜培養(yǎng)。從轉(zhuǎn)化平板上挑取單菌落,用pMD2T載體通用引物(M13247,5′2CGCCAGGGTTTTCCCAGT2CACGAC23′;RV2M,5′2GAGCGGATAACAATT2TCACACAGG23′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,取5μL電泳檢測(cè)。挑取2個(gè)陽性克隆的菌落,增殖提取質(zhì)粒后送大連寶生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。1.2.4　豬肺炎支原體P46的基因序列及推導(dǎo)氨基酸序列的分析　用DNASTAR6.0軟件比較MY299株和國際標(biāo)準(zhǔn)株232株、J株和7446株的P46基因核苷酸及氨基酸一級(jí)序列的異同。2　結(jié)果2.1　豬肺炎支原體P46基因的PCR擴(kuò)增　以豬肺炎支原體MY299株的基因組DNA為模板,用設(shè)圖3　CTB56023和CTB56026與標(biāo)準(zhǔn)株計(jì)的引物擴(kuò)增出了約為1.1kb的特異性條帶(圖1)。232株的P46蛋白氨基酸序列比較

中國畜牧獸醫(yī)　2010年第37卷第4期生物技術(shù)?105?密碼子;一個(gè)CGG是精氨酸的密碼子,為稀有密碼子。用DNASTAR6.0對(duì)2個(gè)克隆測(cè)序結(jié)果與國際標(biāo)準(zhǔn)株232株的P46基因序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),其核苷酸的同源性分別為99.8%和99.2%,編碼的氨基酸序列同源性分別為99.7%和99.2%;與J株和7446株的核苷酸同源性分別為99.5%、99.0%和99.2%、98.8%。CTB56023與標(biāo)準(zhǔn)株232株的P46焰等,2004;Assunca等,2005),說明豬肺炎支原體易發(fā)生變異,而P46蛋白卻具有很高的保守性(覃青松等,2005)。雖然CTB56023和CTB56026與國際標(biāo)準(zhǔn)株232株的P46基因存在著有2～5個(gè)堿基的差異,但其P46蛋白的氨基酸二級(jí)結(jié)構(gòu)和親水性并不受到影響,可作為診斷用膜蛋白抗原。參考文獻(xiàn)1　孫霞,熊焰.豬喘氣病病原的研究[J].中國獸醫(yī)科技,2001,31(5):27～28.2　覃青松,寧宜寶,沈青春.豬肺炎支原體膜蛋白P46基因在大腸基因有2個(gè)堿基的差異,一個(gè)為同義突變,另一個(gè)引起99位的Ile突變成Val;而CTB56026有5個(gè)堿基的差異,其中有兩個(gè)為同義突變,另外25位Thr、96位Asn和356位Val分別突變?yōu)锳la、Lys和Ala(圖3)。3　討論桿菌中的表達(dá)[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2005,27(2):16～19.3　熊焰,孫霞,茍琳.豬肺炎支原體MY299株膜蛋白SDS2PAGE分本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),P46基因?qū)σ锏拿舾行圆⒉桓?基因組DNA的濃度如果低于0.5ng則不會(huì)出現(xiàn)特異性條帶。Caron等(2000)報(bào)道,豬肺炎支原體P46基因擴(kuò)增的敏感性低于P36基因。筆者認(rèn)為,可利用P46基因的保守性進(jìn)行豬肺炎支原體PCR的臨床檢測(cè),同時(shí)對(duì)Mhp的其他保守基因序析及免疫原性研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2004,35(1):74～78.4　AssuncaoP,DelanFeC,nandantigenicvariabilityamongMycoplasmahyopneumoniaestrainsbySDS2PAGEandimmunoblot[J].VeteriaryRearchCommunication,2005,29:563～574.5　BarbaraE,JefferyJ,SylvieD,esofSwine,9thEdi2tion[M].UnitedStates:Wiley2Blackwell,2006,785～787.6　CaronJ,sisandDifferentiationofMycoplas2mahyopneumoniaeandMycoplasmahyorhinisinfectionsinpigs列,如P36、P97等進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增,以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。測(cè)序結(jié)果表明,MY299株P(guān)46基因與國際標(biāo)準(zhǔn)株232株、J株及7446株的同源性分別達(dá)98%以上,說明豬肺炎支原體P46基因具有很強(qiáng)的保守性,且從分子水平上證明了孫霞等(2001)分離的MY299株是典型的豬肺炎支原體菌株。byPCRamplificationofthep36andp46Genes[J].JournalofClinicalMicrobiology,2000,38(4):1390～1396.7　EscobarJ,VanAlstineWG,BakerDH,per2formanceandwhole2bodycomositionofpigxperimentallyinfec2tedwithMycoplasmahyopneumoniae[J].JournalofAnimalSci2ence,2002,80(2):384～391.8　SatoshiF,YasuhiroS,MunenoniO,inant462Kilo2daltonsurfaceantigen(P46)ofMycoplasmahyopneumoniaeex2presdinEscherichiacolicanbeudforearlyspecificdiagnosisofMycoplasmalPneumoniaofswinebyenzyme2linkedimmu2nosorbentassay[J].JournalofClinicalMicrobilogy,1995,33(3):680～683.豬肺炎支原體膜表面的黏附蛋白變異很頻繁(Escobar等,2002)。自然界的豬肺炎支原體,可以自發(fā)的使其表面的膜蛋白抗原發(fā)生大小和結(jié)構(gòu)的變化,在蛋白抗原表面趨近性的形成抗原表位遮蔽物。許多關(guān)于豬肺炎支原體膜蛋白的報(bào)道均有不同(熊SequentialAnalysisofSurfaceProteinP46GeneofMycoplasmahyopneumoniaeWildStrainMY299XIONGDing2jie,XIONGYan,LINLu(CollegeofAnimalScienceandTechnology,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an625014,China)Abstract:　　Mycoplasmahyopneumoniae(Mhp)wildstrainMY299wasculturedinATCCliquidmedium,echnique,eP46ultsofquencingdemonstratedthattheclonedquenceis1134bp,uenceisincludingthreeTGAcodonscodingTrpin182,ingtheP462quenceofMycoplasmahyopneumoniae(Mhp)wildstrainMY299withthequenceofstandard232strainpublishedinGen2Bank,theidentityofthemwere99.6%and99.2%.Keywords:Mycoplasmahyopneumoniae(Mhp);P46gene;quentialanalysis