川芎嗪減少實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠神經元的凋亡與NF-κB信號

2024年3月6日發(作者：得意洋洋的意思)

第23期 鞏麗華，等:川葦嗪減少實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠神經元的凋亡與NF-kB信號通路相關性研究?23?川背嗪減少實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠神經元的

凋亡與NF-kB信號通路相關性研究鞏麗華，周硯秋，王思遠，馬辰旭，侯云$(濱州醫學院基礎醫學院，山東煙臺264003)摘要：探討川莒嗪(Tetramethylpyrazinc,

TMP)對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental

autoimmune

encephalomyelitis,

EAE)小鼠神經元

凋亡的調節作用及其機制°

40只C57BL/6小鼠注射MOG-35-55制劑建立EAE模型,隨機分為PBS組和TMP組,PBS及TMP每日腹

腔注射連續給藥28

d,取腰椎段脊髓，行免疫熒光染色檢測神經元數目’將PC12細胞按照處理不同，分為空白對照組、mteOeoG-y(IFN

-！)處理組、IFN-y+TMP組'各組均行流式細胞術檢測神經元凋亡情況,Weyeo

blotting檢測NF-kB、p-NF-kB表達水平'動物實驗結

果顯示與PBS組相比,TMP能明顯增加神經元的數量(P<0.05)'而細胞實驗結果顯示TMP可有效抑制神經元細胞的凋亡(P<0.05),

且明顯減少了

p-NF-kB的表達(P<0.05)

°

TMP對EAE小鼠有神經保護作用，其機制可能與抑制神經元的凋亡、抑制NF-kB信號通路

有關’關鍵詞：川莒嗪;多發性硬化;神經元;凋亡;NF-kB中圖分類號：R965

文獻標識碼：A

文章編號：1008-021X(

2020)

23-0023-04TetrametUylpyrazize

Decreas

tUe

Nenron

Apoptosis

of

tUe

Experimental

Autoimmune

Encenhalomyelitis

Micc

Through

NF-kB

Signaling

PatUwayGng

Lfua,

Zhou

Yanqia,

Wang

Sfuan,

Ma

Cheexu,

Hou

Yun

*(Colleae

L

Basic

Medicine,

Binzhou

Medical

University,

Yantai 264003,

China)Abstract:

To

explore

the

effects

and

mechanism of

tetramethylpyrazine

(

TMP)

on

neuronal

apoptosis

in

experimental

autoimmune

enceph—omyeli—s

(EAE)

mice.

A total

of

40

C57BL/6

mice

were

injected

with

MOG-35-55

and

pertussis

to

establish

EAE

model.

They

were

randomly

divided

into

PBS

group

and

TMP

group.

PBS

and TMP

were

injected

intraperitoneally

for

28

days,and

lumbar

spinal

cords

of mice

were

obtained

for

immunoLuorescence

staining.

The

PC12

cells

were

divided

into

blank

conOel

group,IFN-y

group

and

IFN-y+TMP

group.

Flow

cytometo was

ud

to

detect

neuron

apoptosis,and

western

blotting

was

ud

to

detect

the

expression

of

NF-kB

and

p-NF-kB.

In

vivo

experiment showed

that

compared

with

the

PBS

group, TMP

can

significantly

reduce

the

neuronal

apoptosis

(

P

< 0.05

).

In

vi—e

experiment

osu/s

showed that

TMP

can

effectively

inhib—

neuronal apoptosis

(

P<0.05)

,and

reduce

the

expression of

p-NF-i

(

P<0.05)

.

Therefore,TMP

has a

neuroprotectivo

effect on

EAE

mice,and

its

mechanism

may

be

related

to

the

inhibition

of

neuronal

apoptosis

and

the

reaula—on

of

NF-kB

signaling

words:tetramethylpyrazine；multipic

sclerosis;

neuron；apoptosis；NF-kB多發性硬化癥(MS)是一種中樞神經系統(CNS)破壞性疾

病,常有炎性脫髓鞘的表現,是一種進行性的自身免疫性疾病。

MS病程反復，病況多呈緩慢進行性加重。該病病變部位彌散,

NF-kB表達和抑制促炎性細胞因子的產生來保護腦缺血-再灌

注損傷，并減輕由此產生的神經損傷癥狀(11-2)。我們前期研究

其癥狀和體征也相對復雜，病因及發病機制未完全明確。MS

的病理生理特征包括炎性反應、血腦脊髓屏障破壞、神經膠質

細胞活化，神經髓鞘脫失及神經元的凋亡等。在腦和脊髓的損

傷過程中,有研究證明首先出現少突膠質細胞的凋亡，隨后，星

形膠質細胞、小膠質細胞陸續被激活，凋亡區最終演變成脫髓

鞘(1勺。同時，研究發現由于缺血、缺氧、感染等因素都會對神

發現,TMP

(

30

mg/kg)能夠通過調節炎癥反應、減少膠質細胞

的活化并保護血-脊髓屏障而顯著地降低EAE小鼠的神經行

為學評分，其緩解神經損傷癥狀(13-4)。而TMP對EAE小鼠神

經元的影響尚未見報道。NF-kB作為一種具備多向性轉錄激活性能的核轉錄因子,

遍布于各種神經細胞中,并參與調節氧化應激及細胞凋亡等病

理生理過程(15)。活化的NF-kB能加劇神經元的凋亡,引發中

經細胞造成損害，其中，神經元對各損傷因素的敏感性更高。

神經元壞死性凋亡會直接影響到中樞神經系統的功能結構，引

發缺血性腦血管疾病［3］、神經退行性疾病⑷等。最新研究表

明，MS病變區的神經元細胞密度明顯減低，神經元細胞的變性

凋亡是引起MS中樞神經癥狀的主要原因灼。因此，減少神經

樞神經系統功能損傷，造成認知能力和記憶減退等,促進神經

退行性病變［16］。在MS患者及動物模型中，腦和脊髓病變處發

現了激活的NF-kB"-8」，多項研究提示NF-kB信號通路在

MS/EAE病程進展中起重要作用。因此，本研究主要是探討并

明確TMP對EAE小鼠神經元的影響及調節機制。我們檢測了

TMP對EAE小鼠神經元凋亡情況的影響，以及TMP對神經元

細胞的凋亡情況和p-NF-kB表達水平的影響。以EAE小鼠和

IFN-y處理后PC

12細胞為實驗基礎,探討了神經元凋亡、NF-

kB

信號通路與MS之間的關系，進一步證明了

TMP是多發性

硬化癥的潛在治療藥劑，旨在為多發性硬化癥的治療尋求新的

靶點。元凋亡成為緩解MS的重要策略。川葦嗪(Tetramethylpyrazine,TMP)是從中藥川夸'嗪中提取

的生物堿［6］,幾百年來，它一直被用于治療腎臟、心臟和腦部疾

病，幾乎沒有不良反應*9)。有學者在大鼠腦出血模型發現，丹

參川葦嗪注射液能夠抑制腦出血大鼠的神經元凋亡［10］。在中

樞神經系統中,TMP治療還可以通過減少神經細胞凋亡、降低

收稿日期：2020-08-26基金項目：山東省自然科學基金(基金號為ZR2016HP05)作者簡介:鞏麗華！

1986"),女，山東蓬萊人，碩士研究生在讀，研究方向:神經炎性疾病的治療急機制研究;通信作者:侯云

山東化工-24

-1材料與方法1-1實驗動物、細胞與試劑SHANDONG

CHEMICAL

INDUSTRY2020年第49卷10

mO后用

儀

波長450

nm

的

度值,計算細

胞存活率，選取后續TMP的使用濃度。依據實驗結果，選TMP

(50

pmol/L)作為后續實驗濃度。1.2.5

SPF級C57BL6

(性，12周齡)，購自

南

實驗

動物中心，PC12

細胞株購買自

Ameocan

Type

Culture

Collection

(ATCC)。MOG35-55

自

HookeLabs,

TMP

來自

Sigma-AldOch

,

清(FBS)、DMEM

(

)培養基和0.25%

化液

自

Gibes公司°抗NeuN兔克隆抗體(

Abeam),

抗兔Alexa-488

抗(Jackson

ImmunoRearch)

,NF-kB、p-NF-)B

抗體(美國

CeC

Signaling)

,ICN--)/(美國

Peprotech)。MTT

自

Sigma-Aldrich

，超敏ECL發

自Thermo公司。由碧云天

技術

(PMSF)、BCA

蛋白濃度

流式細胞術檢測細胞凋亡情況胞分組處理如下：空白對照組,ICN-/

(

100

ng/mL)

組，ICN-/

(100

ng/mL)

+

TMP

(50

pmol/L)組。收集細胞并

用冰冷的PBS洗

次，于200

!L結合緩沖液

培養。B

胞重懸后，每個

品中先加入5

p,L

AnnexinV-FICC混勻，再加

入2

^LPH作液，

混勻，然后在室溫下在黑暗中孵育30

-O,在

胞儀上進行

分析。1.2.6

Western

blotting

檢測蛋白表達：RIPA裂解液、蛋白

抑制劑、SDS-PAGE

-

。1.2方法1.2.1

EAE小鼠模型的建立的細胞

,在冰

用RIPA裂解液裂解胞30

min,然后4

t

13000

r/min離心30

min,取

清。使用

BCA法

白濃度后，加sample

buffer煮沸10 min。 用

白分

50曲在10%

SDS-PAGE

分離目的蛋白，轉膜實驗方案

濱州醫學院實驗 管

會實驗

會

。EAE模型的建立和臨床評分的評估細節參考 問。 隨

分為

:PBS組(n

=

20)、TMP組(30mg/kg,n

=

20)。

后,5%脫

粉

室溫1

h,滴加一抗：NF-kB、p-NF-kB,4t孵

，室溫復溫1h后,TBST液洗膜后，滴加相關二抗，洗滌、使用ECL顯色。注射自免疫后第13

始進1.3統計學分析數據采用

分析軟件SPSS19.0進行

分

。計資料數據以平

士SEM表示。

數據比較采用

素分析(ANOVA)檢驗，經

Bonferroni

0

,p

<0.05

被認為學意義。行，

腹腔注射15

d后死。1.2.2免疫熒光染色檢測神經元的數量后，取腰椎段脊髓。首先經4%的多

4t后

6h后，換30%的蔗糖4

t放置

EAE.

3

d后，經OCT包埋劑-80

t

保存，用

冰凍切片。切片后

4%多

灌

免疫熒光染

神

的數量。具體操作如下：

切片于2結果2.1

TMP能改善EAE小鼠的臨床評分EAE模型構建成功后,PBS組及TMP

(

30

mg/kg

)組24孔培養

用含抗兔來源抗NeuN的單抗的PBS

4

t孵，第

天室溫復溫1h后,PBS清洗三遍，加入稀釋的 抗Alexa-488的

抗室溫避光孵育2

h,后PBS清洗三遍，加入

稀釋的DAPC染核室溫孵育15

min后,PBS清洗后用抗熒光淬

的封片劑封片后

顯微鏡下 片。1.2.3

PC12現

度發病，表現為反應、食

及體重下降等，逐現尾部無力,嚴重者

。

現死亡。與PBS組對比,TMP(

30

mg/kg

)組顯著降低了平均神經行為學評

分

神經行為學評分(p<0.05)[14]o

結果表明，TMP清、5%

清，100U/mL青霉素*100

mg/mL鏈霉素的DMEM培養基中，置

37

t*

PC

12

細胞接

10%

治療能夠改善EAE

2。的神

狀，恢復

的神經功2.4

TMP對EAE小鼠的神經細胞數量的影響TMP(30

mg/kg

)治療EAE小鼠后，神經行為學評分改善

5%

CO2細胞培養箱中培養。細胞呈

長至細胞80%~90%

代。長，天換液，待合時，用0.25%胰蛋白

化后，按1：3表明中樞神

神

損程度

。進行免疫熒光染色1.2.4

CCK8法檢測細胞的存活率細胞傳代過夜后，使用ICN-/

(

100

ng/mL)干預處理細胞

2

h后，加入不同濃度的TMP

(0,25,50,100,200

pnol/L)繼續

培養24

h。每孔加入CCK8溶液10

p,L,37

t孵育4

h,低速振脊髓神經元數

化，與PBS

比,TMP(

30

mg/kg

)組陽性表達NeuN的神

胞數量顯

力卩(P<0.05)

(

1)。

表明,TMP治療

少中樞神

神經元細胞的凋亡，從

EAE的臨床嚴重程度。A：

NeuN在各組的表達;B：

NeuN陽性表達細胞數量統計；*

*

P<0.01

/

P<0.05

圖1

NeuN在各組的表達情況的干預作用。且TMP

(50

pmol/L)能夠最大程度地減少ICN-

2.3

TMP對ICN-/干預后PC

12細胞存活率及凋亡

的抑制作用！P<0.05)

(

2)。

，我

了

TMP對的影響ICN-/干預后PC

12凋亡的 。與空白對照組比較,ICN-!ICN-/是EAE發病過程中分泌的主要Th1型炎性細胞因

'ICN-/+TMP：

胞凋亡

明顯升高；與

純ICN-/比子。

，體

實驗

用ICN-/刺激神

。結果發現，與較,TMP處理后細胞凋亡數量顯著下降。綜結果說明，TMP

空白對照組比較,ICN-!

(100

ng/mL)顯

降低了神

的活

。

TMP

作用后，

呈濃度

性降低了

CFN-!抑制ICN-/刺激所引起的神

凋亡(圖2)。

第23期

鞏麗華，等:川葦嗪減少實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠神經元的凋亡與NF-xB信號通路相關性研究A100806040A20l

=_qe>=a。?25?c**%>s￡dode

a一一oWild IFN-y

200 TMP(uM)IFN-y +TMPBWildIFN-yIFN-y

+

TMP21:.g111

imi|

i

ii

iiui|FITC-AFITC-AA：

TMP對IFN-!干預后PC

12細胞存活率的影響；B：

TMP對IFN-干預后PC

12細胞凋亡的影響;

C：

TMP對IFN-干預后PC

12細胞凋亡數目統計；**

P<0.01,

*

P<0.05圖2

TMP對DN-!干預后PC

12細胞存活率及凋亡的影響2.4

TMP對DN-

干預后PC

12細胞中p-NF-KB的

表達影響與空白對照組比較，【測-增加了

p-NF-kB/NF-kB的表

達(P<0.05)；與

DN-組比較,p-NF-kB/NF-kB

的表達在

DN

—+TMP組顯著降低！P<0.05)(圖3)。

，TMP治療

少P-NF-kB/NF-kB的表達，表明NF-kB信號通

和腦部疾病，應用范圍

TMP在中樞神經損傷

少

反應。近年來

發現,進增殖，

模型中，能夠保護神

胞存活、促善后肢運動[23]。

題

期

發現,TMP少

胞治療可顯著降低EAE小鼠的臨床評分,其作用

在TMP、抑制神

胞的活化和保護血腦屏障，證明TMP是極

的MS治療藥物[13-4]。 實驗用TMP來處理對神

的保護作用，以期對TMP的神經保護作用

加完善的實驗依據。胞凋亡

胞主動死亡的機體調節

，能夠維持胞內環境的穩

神

胞代謝平衡。多

明細胞凋亡與神經退行性疾病的發病

關，

腦

、帕金病、 默

MS[24]

o

，神

凋亡在MS的發展關

，是MS常見特征之一[25]。

,我利用

DN-干預的PC

12

胞，

保護神經元減少凋亡的作用中起到關鍵作用。----------------------------I*胞術、免疫熒光染

DN-干預的PC

12

胞進行

法，對

EAE.

以及，證明TMP治療能顯著降低(言

炎性環境中神

的凋亡情況。實驗結果表明，TMP可以改善EAE模型

現的神經退行性病變,保護EAE小鼠的神

|胞，神

的凋亡。B：

p-NF-kB/NF-kB

的表達比值統計；*

*

P<0.01,

*

P<0.05

圖3

TMP對IFN-干預后PC

12細胞中p-NF-xB的表達的影響

suapreoKo)Wild IFN-y

IFN-y

+

TMP激活NF-kB可以通

節下

子促進細胞凋亡和應激反應的發展。NF-kB被激活后，能夠引起神

的凋亡，引發樞神

功能損傷,促進神經退行性病變[16]。在MS患者及

模型中，腦

脊髓病

發現了激活的NF-kB[17-8]，多NF-kB信號通路在MS/EAE病

進展中起重要作

:B、NF-kB在各組的表達；用。

3討論多發性硬化

免疫

介導的中樞神

統的退行性疾病，多年來，抗

反應、抑制脫髓鞘

胞凋亡一直是MS治療的關

[20]o

尚 明確多發性硬化的發我對p-NF-Kb/NF-xB的蛋白表達水平進行,明TMP治療能顯著降低神

p-NF-kB/NF-kB的表達，說明TMP調控神

凋亡的途徑

與NF-kB信號通關。綜

，本實驗中用TMP干預EAE小鼠模型及DN—干預的PC

12

胞，能夠降低EAE小鼠的臨床評分，對

神

損傷癥狀

緩解作用，抑制了神

的凋亡

降低了NF-xB的表達。

見，TMP'

的治療MS的藥物，但其在MS患者中的進

應用

病機制，其病

狀和體征

對復雜，

仍然缺乏切實有探索。的治療藥物。近年來，多

治療MS的新型藥物的面世，在獲

得治療作用的

面臨著

的安全性

。

，MS的主要治療方法包括使用

的*-干擾素[21]、

，然而它們的缺點明顯：

常用藥

重心臟負擔。

、與樞神

的結合能力差。引起腸道副反應，

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?中國組織工程研究，2019,23

(

11

)：

1730-1737.[23]

HU

J,

LANG

Y,

CAO

Y,

et

neuroprotectivo

effect

L

[12]

FAN

L,

WANG

K,

SHI

Z,

et thylpyozine

protects

spinal

cord

and

reduces

iidlammation

in

a

rat

model

of

spinal

cord

ischemia-opeOusion

injuo

[

J

]

-

J

Va

Sury,

2011,54tetramethylpyrazine

against

contusive

spinal

cord

inju—

by

activating

pgc-1a

in

rats

[

J

].Neuochem

Res,

2015,40(

7

):

1393%1401.[24]

WU

J

R,

WANG

J,

ZHOU

S

K,et

al葡ecostatin-1

protection

(1)：

192-200.[13]

BAI

X

Y,WANG

X

F,ZHANG

L

S,et

thylpyozine

ameliorates

experimental

autoimmune encephalomyelitis

by

modulating

the

infammatoo

respon

[

J

].

Biochem

Biophys

ResCommun,2018,503(

3)

：

dopaminergic

neurons

[

J

]. Neural

Regeneration

Rearch,

2015,10(7)：1120-1124.[14]

ZHANG

L,LU

X,

GONG

L,

et

thylpyozine

protects

blood

-

spinal

cord

b—Oer

inteaOty

by

modulating

microglia

poeaaoiaioon

ihaough

acioeaioon

oeSTAT3

LSOCS3

and

onhoboioon

of NF

-

kB

signaling

pathways

in

experimental

autoimmune(本文文獻格式:鞏麗華，周硯秋,王思遠，等原I茸嗪減少實驗性

自身免疫性腦脊髓炎小鼠神經元的凋亡與NF-kB信號通路相

關性研究[J].山東化工,2020,49(23)

:23-26.)熱鋼金相組織的浸蝕劑及其使用方法:CN107063816A

[

P],

2017-03-10.(上接第22頁)(2)

顯示T/P91、92鋼中(-鐵素體、鑒別回火與未回火及

兩相區組織推薦采用電解浸蝕法，電解浸蝕劑推薦采用10%硫

酸或過硫酸錢水溶液。(3)

顯示

S30432、TP347HFG、TP310HCbN

三種耐熱不銹鋼

固溶態組織時，應首選電解浸蝕進行晶界與組織形貌的顯示。

其中，固溶態S30432與TP347HFG應采用濃硝酸電解浸蝕顯示

晶界，用10%草酸電解浸蝕顯示組織形貌;對TP310HCbN應首

[3]

王俊海，朱

榮,姚占山，等.不銹鋼金相腐蝕劑的選擇[J].

四川冶金,2016,38(2)

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選濃硝酸或10%硫酸電解浸蝕顯示晶界與組織形貌。(4)

顯示

S30432、TP347HFG、TP310HCbN

三種耐熱不銹鋼

時效態組織時，應采用化學浸蝕法，推薦采用鹽酸苦味酸水溶

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織顯示[J].山東化工,2020,49(23)

：

18-22+26.)