一種快速分離檢測產脂肽類生物表面活性劑枯草芽孢桿菌的方法_

2024年3月12日發(作者：300字日記大全)

一種快速分離檢測產脂肽類生物表面活性劑枯草芽孢桿菌的方

法

王大威;張健;姜偉;張鳳久

【摘 要】脂肽(Lipopeptide)是由枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等微生物產生的

一類具有較強表面活性的生物表面活性劑.枯革桿菌磷酸泛酰巰基轉移酶基因(afp)

是枯草芽孢桿菌中參與脂肽代謝的功能性基因.采用sfp基因PCR對從環境中得到

的一組產生表面活性劑的微生物進行篩選,結合Tricine-SDS-PAGE電泳對PCR結

果呈陽性的菌蛛的代謝粗初提物進行檢測,初步鑒定得到兩株枯草芽孢桿菌.進一步

利用16S rDNA序列的系統發育學分析確定這兩種菌株為枯草芽孢桿菌,并利用

TLC、HPLC鑒定其產物為脂肽類表面活性劑,從而建立了一套快速分離檢測產生脂

肽類生物表面活性劑的枯草芽孢桿菌方法.

【期刊名稱】《生物技術通報》

【年(卷),期】2011(000)009

【總頁數】5頁(P142-146)

【關鍵詞】脂肽;枯草芽孢桿菌;sfp基因;Tricine-SDS-PAGE;電泳

【作 者】王大威;張健;姜偉;張鳳久

【作者單位】中海油研究總院,北京100027;海洋石油高效開發國家重點實驗室,北

京100027;中海油研究總院,北京100027;海洋石油高效開發國家重點實驗室,北京

100027;中國海洋石油總公司,北京100027;中國海洋石油有限公司,北京100027

【正文語種】中 文

脂肽(Lipopeptide)又名脂酰肽(Acylpeptide)，是由親水的肽鍵和親油的脂肪烴鏈

兩部分組成的小肽，由于其特殊的化學組成和兩親型分子結構，脂肽類生物表面活

性劑顯示了十分優良的特性，在醫藥、食品、化妝品、環境治理和微生物采油等領

域都有廣泛的應用[1] 。大多數脂肽來源于微生物，而其中以來源于細菌的脂肽居

多。目前發現的脂肽類生物表面活性劑有10余種，主要包括Surfactin、

Lichenysin、Iturin和Fengysin等[2] 。其中表面活性素(Surfactin)是一類環狀結

構的脂肽(圖1)，具有良好的表面活性，能增加憎水烴類的生物可獲得性，激發烴

的生物降解，與部分重金屬結合能移除被污染的土壤和沉積物中的重金屬;同時，

還具有特殊的生物活性，能提高尿激酶的活性，防止血液凝結。脂肽類生物表面活

性劑發現35年來，盡管相比于化學合成表面活性劑，其具有諸多優點，但目前脂

肽類表面活性劑的應用還十分有限。這主要是因為發現的產生脂肽的菌株較少，公

開報道只有20株菌株可以產生脂肽[3] 。

近年來，人們一直采用血平板法和擴油圈法篩選產生物表面活性劑的菌株，這些方

法不僅工作效率低，且不能有效將產脂肽的微生物從中區分開;同時鑒定微生物產

生的脂肽的方法一般都采用高效液相色譜(HPLC)、核磁共振(NMR)、質譜對純化

的產物進行分析，這些檢測手段對產物的純度要求較高，但脂肽類生物表面活性劑

純化需要經過酸化沉淀、冷凍干燥、真空抽干等繁瑣的工序，費時而且效率低，因

此如何快速篩選產生脂肽類表活劑的微生物一直是困擾研究人員的主要問題。

枯草桿菌磷酸泛酰巰基轉移酶基因(sfp)位于srf操縱子的下游(圖2)，片段長4 kb，

是參與脂肽代謝的第二調控元件。Nakano等[4] 確定了sfp基因的核酸序列，其

編碼枯草桿菌磷酸泛酰巰基轉移酶(SFP)屬于 4-phosphopantetheinyl

transfera超家族。Hsieh等[5] 曾報道針對sfp基因合成引物，建立快速鑒定產

脂肽的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的方法，但該方法后期同樣采用傳統的

HPLC(高效液相色譜)對菌株產物進行分析，在產物純化時還是會消耗大量的時間

和人力。

考慮到采用常規方法分離純化微生物產生的脂肽存在的諸多困難，本研究擬采用以

往蛋白質分離常用的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法對代謝產物進行分析。聚

丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法是分離蛋白質的常用生化方法，該方法簡便、快

速、價廉、不需要對蛋白或肽類進行過多處理，并具有相對較高的分辨率，但由于

Bacillus屬細菌所合成脂肽的相對分子量多在1 kD左右，為避免SDS微團對蛋白

質分離產生干擾，本研究采用80年代末由Schagger和von Jagow首創的三羥

甲基氨基甘氨酸Tris-tricine緩沖系統[6] 對脂肽進行分析。該系統可使小蛋白質-

SDS復合物與SDS微團分離，去除干擾，最小可分離1－10 kb的蛋白質，10多

年來，一直利用這種較簡便的不連續梯度膠分離小分子肽。

本試驗采用sfp基因PCR結合Tricine-SDSPAGE電泳擬建立一套快速分離檢測

枯草芽孢桿菌及其產物脂肽的方法，減少在菌株分離和產物純化過程中的對人力和

時間的浪費，加快分離目標菌株的進程，為今后現場篩選脂肽類表面活性劑產生菌

株提供可靠的方法。

1.1.1 菌株 10株現場分離的產生生物表面活性劑的未知菌株，標準菌株為本實驗

室保存的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ZW-3。

1.1.2 培養基 液體培養基用基本無機鹽培養基：K2HPO4·3H2O 4.8 g，

KH2PO41.5 g，MgSO4·7 H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.2 mg，三水合檸檬酸鈉

0.5 g，酵母浸出物0.1 g，氮源為1 g硫酸銨，葡萄糖為碳源，加水配成1 L溶液。

固體培養基另加2%的瓊脂，121℃滅菌20 min。

1.1.3 標準品 脂肽標準品購自于Fluka(Sigma)。

1.2.1 sfp基因的PCR擴增 將初篩的菌株接種于搖瓶培養基中180 r/min 37℃振

蕩培養3 d。基因組 DNA的提取參考分子克隆實驗指南(第3版)[7] 。sfp基因的

PCR擴增方法參考文獻[5] 。提取細菌基因組DNA，以其為模板PCR擴增sfp基

因。引物f(5'-ATGAAGATTTACGGAATTTA-3')和r(5'-

TTATAAAAGCTCTTCGTA-3')由上海生工生物工程有限公司合成。PCR體系采用

20 μL，反應體系：10×PCR 緩沖液(含 MgCl220 mmol/L)2 μL，Taq DNA 聚合

酶 0.2 μL，10 μmol/L 引物各 1 μL，DNA 模板 1 μL，去離子水 13.8 μL。PCR

擴增程序：94℃ 10 min;94℃ 1 min，46℃ 30 s，72℃ 1 min。共25個循環;72℃

10 min。PCR產物在2%瓊脂糖凝膠中電泳進行檢測。

1.2.2 Tris-tricine緩沖系統丙烯酰胺凝膠電泳

參照文獻[8] ，將PCR陽性菌株接種于搖瓶培養基中180 r/min 37℃振蕩培養3

d，發酵液8 000 r/min離心10 min，棄菌體沉淀。制膠方法與普通Tris-Gly系

統相同，注意電泳槽內分別加入陰極和陽極電泳緩沖液，將上清液和Surfactin脂

肽標準品溶液(400 μg/mL)上樣后，先在30 V恒壓下電泳1 h，然后在150 V恒

壓下電泳4 h，溴酚藍前沿即可移動到離底部約0.5－1 cm，停止電泳，凝膠小心

取下后，浸入染色液中染色，而后脫色、保存。電泳后，凝膠首先經考馬斯亮藍

G-250染色液初染，再使用油紅O進行了第二次染色，油紅O為脂溶性染料，用

于脂類染色。

1.2.3 16S rDNA基因的序列分析 為最終確定PCR擴增呈陽性及產物經Tricine-

SDS-PAGE電泳為脂肽的目標菌株的種屬，對其進行16S rDNA基因的序列分析。

以細菌基因組DNA為模板，擴增引物采用細菌通用引物B14926(5'-

CCGGATCCAGAGTTTGATCCTGGTCAGA-ACGAACGCT-3')和B14927(5'-

CGGGATCCTACGCCTACCTTGTTACG ACTTCACCC-3')(上海生工生物技術有限

公司合成)。PCR反應體系選用20 μL反應體系：10×PCR緩沖液(含 MgCl220

mmol/L)2 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL，10 μmol/L 引物各 1 μL，DNA 模板 1

μL，去離子水13.8 μL。PCR擴增程序：94℃ 10 min;94℃45 s，55℃ 60 s，72℃

70 s，共 30 個循環;72℃ 10 min。擴增的PCR產物連接到載體pMD18-

T(TaKa-Ra)上，轉化 DH5α。提取有16S rDNA插入的質粒并測序，序列

測定由北京三博遠志公司完成。1.2.4 脂肽薄層層析(TLC)鑒定 脂肽薄層層析方法

參照文獻[9] ，將分離得到的表面活性劑樣品溶解在二氯甲烷中配成溶液。取兩塊

活化的薄板，記為A板、B板，每塊板分別點樣，在氯仿∶乙酸=8∶2(V/V)中展

開10 min。揮發掉溶劑后，A板直接以茚三酮試劑(0.15%的茚三酮丙酮溶液)顯

色。把B板放入耐高溫的密封瓶內，瓶中預先以小杯盛約1 mL濃鹽酸，110℃烘

箱中熏蒸1 h進行原位酸水解，通風櫥中冷卻，吹去鹽酸后，以茚三酮試劑顯色。

1.2.5 脂肽高效液相色譜(HPLC)鑒定 為進一步驗證Tricine-SDS-PAGE電泳的有

效性和穩定性，對脂肽表面活性劑進行純化。純化樣品采用高效液相色譜進行檢測，

流動相 A(40%乙腈 +60%10 mmol/L醋酸銨，pH6.9)，流動相 B(乙腈)，進行梯

度洗脫，0－10 min內B相由10%變到25%，流動相1.0 mL/min、反相C18柱、

紫外215 nm檢測即可。

sfp基因PCR產物電泳(圖3)顯示10株生物表面活性劑代謝菌株中，ZW-4、

ZW-8在675 bp處有條帶，與正對照菌株一致，可以初步判定為枯草芽孢桿菌。

對細菌發酵液離心上清電泳后，凝膠首先經考馬斯亮藍G-250染色液初染，發現

發酵液最前沿條帶呈淺藍色，其遷移距離與Surfactin脂肽標準品相同。為了進一

步確認該條帶為脂肽，經油紅O染色后，原本呈淺藍色的最前沿條帶和Surfactin

脂肽都被染成紅色，可確定該條帶為脂肽，電泳結果如圖4所示。

染色體DNA用PCR擴增出單一條帶，PCR產物回收純化后，經DNA測序，序

列長度為1 426 bp，與GenBank中現有的菌種的16S rRNA基因序列比對，進

一步確定 ZW4、ZW8菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，與sfp基因PCR

結果、Tris-tricine凝膠電泳結果吻合。

將純化脂肽進行薄層層析，使用氯仿/乙酸為展開劑，以Surfactin標準樣為對照，

層析結果如圖5所示，樣品與Surfactin相當，并且只呈現1個斑點，證明樣品被

純化，菌株代謝產物為脂肽(Surfactin)。

細菌發酵液經純化后得到脂肽純品采用HPLC與標準品進行檢測。由圖6可見，

脂肽經HPLC分離后出現了5個主要的峰，保留時間分別為14.386、19.982、

24.680、27.392 和28.098 min，標準品 HPLC 結果在 14.562、21.280、

24.091、29.081 和29.827 min處也各有5個峰，這5個峰可能是表面活性素

(Surfactin)的同系物，因此初步認定純化樣品中保留時間為為 14.386、19.982、

24.680、27.392和28.098 min的峰為表面活性素(Surfactin)。因此證明Tris-

tricine電泳的正確性。

脂肽的生物合成是由表面活性素合成酶基因操縱子(srf operon)復合多酶體系催化

進行的，其中，SrfA-C起硫酯酶的作用，SrfA-C-TE基因位于它的C-末端，直接

參與脂肽生物合成，其他一些研究認為sfp基因在脂肽合成中也起重要作用[10] 。

換言之，srfA-C-TE和sfp基因在脂肽的合成中都是必不可少的。所以在本研究中，

針對sfp基因序列和srfA-C-TE基因序列設計了探針，試驗發現sfp基因PCR結

果相對于SrfA-C-TE基因PCR結果更加穩定，說明它是嚴格保守的基因序列，所

以本研究選擇該段基因序列設計了一組探針。

本研究采用SDS-PAGE對細菌代謝物進行快速分離和鑒定，但脂肽分子多為1 kD

左右，而常規的Tris-甘氨酸－鹽酸系統中電泳分離分子量小于10 kD的多肽效果

差。國外曾經報道了分離小分子肽的三羥甲基氨基甘氨酸(Tricine)-SDS-PAGE方

法(有效分離 1 kD小肽 Tricine-SDS-PAGE方法-1)，用Tricine代替甘氨酸作為

尾隨離子，在pH8.45的濃縮膠中，它的遷移速度遠遠快于甘氨酸，使快慢離子間

的區域更窄，其結果是對小分子蛋白質的濃縮更有效。凝膠制作采用二層不連續膠

的結構，由致密膠+夾層膠+濃縮膠構成，靜置以聚合形成三明治式的不連續梯度

凝膠。通過調整聚丙烯酞胺凝膠的分子組成后，可以改善分離脂肽的效果;同時進

一步加入尿素后，凝膠能清晰地顯示1 kD的帶型，可見尿素能增強分離效果。

脂肽是一類重要的生物表面活性劑。相比于化學合成表面活性劑，生物表面活性劑

具有可生物降解和低毒的特點，但目前由于生產成本，生物表面活性劑在食品、農

業化工、石油開發方面的應用還不廣泛。因此，進行目前的研究有利于快速發現產

脂肽生物表面活性劑的菌種對于降低脂肽生產成本意義重大。

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