一種低溶血性抗菌脂肽及其制備方法[發明專利]

2024年3月12日發(作者：同享)

(19)中華人民共和國國家知識產權局

*CN102311483A*

(10)申請公布號 CN 102311483 A

(43)申請公布日 2012.01.11

(12)發明專利申請

(21)申請號 2.9

(22)申請日 2011.07.13

(71)申請人大連伊美生物科技有限公司

地址116000 遼寧省大連市沙河口區富民路

120號

(72)發明人趙春暉 賴宏森

(51).

C07K 7/06

(2006.01)

C07K 1/20

(2006.01)

C07K 1/06

(2006.01)

C07K 1/04

(2006.01)

A61K 38/08

(2006.01)

A61K 8/64

(2006.01)

A61P 31/00

(2006.01)

A61Q 1/00

(2006.01)

A23L 1/305

(2006.01)

權利要求書 2 頁 說明書 4 頁

序列表 1 頁 附圖 1 頁

(54)發明名稱

一種低溶血性抗菌脂肽及其制備方法

(57)摘要

本發明屬生物化學領域，具體涉及一種低溶

血性抗菌脂肽及其制備方法。本發明公開了一種

抗菌脂肽，其序列為Octanoly(C8)-KKKWPW

及其

衍生物或活性片段，其具有廣泛的抗菌活性，并具

有較低的溶血性。該抗菌脂肽或其衍生物或與多

種載體混合，制成注射劑、口服制劑、透皮吸收制

劑、黏膜吸收劑等用于臨床，也可作為抗菌制劑應

用于食品、化妝品等。

C

N

1

0

2

3

1

1

4

8

3

A

CN 102311483 A

CN 102311484 A

權 利 要 求 書

1/2頁

1.一種低溶血性抗菌脂肽，其特征在于：其序列為Octanoly(C8)-KKKWPW。

2.一種低溶血性抗菌脂肽的制備方法，其特征在于：

（1）稱取適量Fmoc Rink-Amide MBHA樹脂置于固相反應器中，用大約2.5 倍體積的

DCM(二氯甲烷)充分溶脹30 min后真空泵抽干，加入DMF(N,N-二甲基甲酰胺)洗滌樹脂

兩次，然后將脫帽試劑放入固相反應器反應5 min，用真空泵抽干，重新加入脫帽劑反應10

min，用真空泵抽干，分別用DMF、無水甲醇、DCM洗滌樹脂兩次，接著用茚三酮法檢測至樹脂

成黑色或紫色；然后樹脂用DMF潤洗一次，加入Fmoc-Trp(Boc)-OH、DMF、DIEA及HBTU的混

和均勻液體，在室溫下反應40 min，真空泵抽干，分別用DMF、無水甲醇、DCM洗滌，取少量樹

脂用茚三酮法檢測若無色，則說明反應完全；

（2）在步驟（1）得到的樹脂中，加入脫帽試劑，室溫反應5 min，抽干，重新加入脫帽劑

反應10 min，抽干，洗滌，加入Fmoc-Pro-OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均勻液體，在室溫下

反應40 min，抽干，洗滌，抽干，茚三酮法檢測若無色，則說明反應完全；

（3）在步驟(2)得到的樹脂中，加入脫帽試劑，室溫反應5 min，抽干，重新加入脫帽劑

反應10 min，抽干，洗滌，加入Fmoc- Trp(Boc)-OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均勻液體，在

室溫下反應40 min，抽干，洗滌，抽干，茚三酮法檢測若無色，則說明反應完全；

（4）在步驟(3)得到的樹脂中，加入脫帽試劑，室溫反應5 min，抽干，重新加入脫帽劑

反應10 min，抽干，洗滌，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均勻液體，在室

溫下反應40 min，抽干，洗滌，抽干，茚三酮法檢測若無色，則說明反應完全；

（5）在步驟(4)得到的樹脂中，加入脫帽試劑，室溫反應5 min，抽干，重新加入脫帽劑

反應10 min，抽干，洗滌，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均勻液體，在室

溫下反應40 min，抽干，洗滌，抽干，茚三酮法檢測若無色，則說明反應完全；

（6）在步驟(5)得到的樹脂中，加入脫帽試劑，室溫反應5 min，抽干，重新加入脫帽劑

反應10 min，抽干，洗滌，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均勻液體，在室

溫下反應40 min，抽干，洗滌，抽干，茚三酮法檢測若無色，則說明反應完全；

（7）在步驟(6) 得到的樹脂中，加入脫帽試劑，室溫反應5 min，抽干，重新加入脫帽劑

反應10 min，抽干，洗滌，加入正辛酸、DMF、DIEA及HBTU的混和均勻液體，在室溫下反應40

min，抽干，洗滌，抽干，茚三酮法檢測若無色，則說明反應完全，用DCM重新洗滌兩次，樹脂

真空干燥；

（8）把干燥后的樹脂倒入玻璃的茄形瓶中，冰浴降溫，加入切割試劑（81.5% TFA+1%TIS

+5%DIWater +2.5%EDT +5%苯甲硫醚 +5%苯酚）攪拌反應10 min后室溫攪拌3-4 h，

過濾除去樹脂，加乙醚沉淀，離心，乙醚洗滌，得到的固體減壓抽干，即得粗品；粗品經制備

HPLC純化，冷凍干燥，得到純品。

3.根據權利要求2所述的一種低溶血性抗菌脂肽的制備方法，其特征在于：脫帽試劑

組分和體積比為：哌啶：DMF=1：4；Fmoc-Trp(Boc)-OH的摩爾數為樹脂的2-4倍；HBTU的摩

爾數為樹脂的2-4倍；DIEA的摩爾數為樹脂的2-6倍；Fmoc-Pro-OH的摩爾數為樹脂的2-4

倍；Fmoc- Lys(Boc)-OH的摩爾數為樹脂的2-4倍；Fmoc- Phe-OH的摩爾數為樹脂的2-4

倍；正辛酸的摩爾數為樹脂的2-4倍。

4.根據權利要求2所述的一種低溶血性抗菌脂肽的制備方法，其特征在于：Fmoc

Rink-Amide MBHA樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5-15 mL/g；Fmoc Rink-Amide

2

CN 102311483 A

CN 102311484 A

權 利 要 求 書

2/2頁

MBHA樹脂的重量與DMF的加入量的比例為5-12 mL/g；Fmoc Rink-Amide MBHA樹脂的重量

與DMF、無水甲醇、DCM的加入量的比例為5-12 mL/g。

5.根據權利要求1所述抗菌脂肽在制備抗菌藥物中的應用。

6.根據權利要求1所述的抗菌脂肽，其特征在于：其衍生物或活性片段包含權利要求1

所述的氨基酸序列或片段。

7.根據權利要求1所述的脂肽可以應用于食品、化妝品，可以與藥學上可接受的載體

混合，制成注射劑、口服制劑、透皮吸收制劑、黏膜吸收劑。

3

CN 102311483 A

CN 102311484 A

說 明 書

一種低溶血性抗菌脂肽及其制備方法

1/4頁

技術領域

[0001]

本發明屬生物化學領域，具體涉及一種低溶血性抗菌脂肽及其制備方法。

背景技術

抗生素自被發現以來就成為人類與感染性疾病進行斗爭的有利武器。抗生素的發

現和進入臨床應用，拯救了千千萬萬受病菌感染病人的生命。近年來，由于環境和人為因素

導致耐藥菌不斷產生，甚至出現了能抵抗大多數可用抗菌素的超級細菌。嚴重降低了普及

型抗生素的治療效果，給感染性疾病的控制和治療帶來了極大的困難，同時也給人類的健

康帶來了潛在的威脅(饒賢才,2004)。 新型抗生素因此成為當今藥物研究領域中日益受

到重視的方向之一。

[0003]

抗菌肽廣義上是指存在于生物體內具有抵抗外界微生物侵害、消除體內突變細胞

的一類小分子多肽。7 0年代末，研究者從昆蟲體內發現了抗菌肽，也稱為肽類抗生素，是生

物體內經誘導產生的一類具有生物活性的小分子多肽。后來，人們陸續從細菌，真菌，昆蟲，

被囊類動物，兩棲類動物，鳥類，魚類，哺乳類以及人類中分離出1500多種陽離子抗菌肽。

這些從生物體中分離出來抗菌肽是組成生物體非特異性防御系統的重要組分，能夠有效的

作用于革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、真菌、寄生蟲、包膜病毒以及癌細胞。

[0004]

來自自然界的抗菌肽具有來源廣泛、結構多樣、活性確切等優點，但它們大多數具

有分子量較大、易于代謝失活、具有抗原性或者具有一定的毒性、天然提取工藝復雜、天然

資源有限等等缺點，真正將天然抗菌肽推向市場可能還要面臨很多挑戰。因此，通過研究分

析天然抗菌肽的特點，了解其結構功能，分析序列特點，對這些活性先導物進行結構改造或

是以其為藍本進行全新設計及合成的化學合成抗菌肽為解決這一難題提供了有效途徑，具

有重要的意義。

[0002]

發明內容

[0005]

本發明的目的是提供一種能夠抑制革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌及真菌生長的抗

菌脂肽。并提供一種工藝簡化、成本降低、工時減少、操作安全的脂肽固相合成方法。

[0006]

本發明的另一個目的是提供上述抗菌脂肽的化學合成方法。

[0007]

本發明的另一個目的是提供上述抗菌脂肽及其活性片段在制備抗菌藥物中的應

用。

[0008]

本發明的抗菌脂肽，其序列為Octanoly(C8)-KKKWPW。

[0009]

本發明的抗菌脂肽采用化學合成法合成，可以是液相合成，也可以是固相合成。

[0010]

本發明篩選得到的抗菌脂肽可廣泛地對抗已具有抗藥性的菌株及醫藥上重要的

真菌。本發明的抗菌脂肽對于人的紅血球有非常低的溶血性。

[0011]

本發明還提供了一種低溶血性抗菌脂肽的制備方法。

[0012]

（1）稱取適量Fmoc Rink-Amide MBHA樹脂置于固相反應器中，用大約2.5 倍體積

的DCM(二氯甲烷)充分溶脹30 min后真空泵抽干，加入DMF(N,N-二甲基甲酰胺)洗滌樹

4

CN 102311483 A

CN 102311484 A

說 明 書

2/4頁

脂兩次，然后將脫帽試劑放入固相反應器反應5 min，用真空泵抽干，重新加入脫帽劑反應

10 min，用真空泵抽干，分別用DMF、無水甲醇、DCM洗滌樹脂兩次，接著用茚三酮法檢測至樹

脂成黑色或紫色。然后樹脂用DMF潤洗一次，加入Fmoc-Trp(Boc)-OH、DMF、DIEA及HBTU的

混和均勻液體，在室溫下反應40 min，真空泵抽干，分別用DMF、無水甲醇、DCM洗滌，取少量

樹脂用茚三酮法檢測若無色，則說明反應完全。

[0013]

（2）在步驟（1）得到的樹脂中，加入脫帽試劑，室溫反應5 min，抽干，重新加入脫

帽劑反應10 min，抽干，洗滌，加入Fmoc-Pro-OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均勻液體，在室

溫下反應40 min，抽干，洗滌，抽干，茚三酮法檢測若無色，則說明反應完全。

[0014]

（3）在步驟(2)得到的樹脂中，加入脫帽試劑，室溫反應5 min，抽干，重新加入脫

帽劑反應10 min，抽干，洗滌，加入Fmoc- Trp(Boc)-OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均勻液體，

在室溫下反應40 min，抽干，洗滌，抽干，茚三酮法檢測若無色，則說明反應完全。

[0015]

（4）在步驟(3)得到的樹脂中，加入脫帽試劑，室溫反應5 min，抽干，重新加入脫

帽劑反應10 min，抽干，洗滌，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均勻液體，

在室溫下反應40 min，抽干，洗滌，抽干，茚三酮法檢測若無色，則說明反應完全。

[0016]

（5）在步驟(4)得到的樹脂中，加入脫帽試劑，室溫反應5 min，抽干，重新加入脫

帽劑反應10 min，抽干，洗滌，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均勻液體，

在室溫下反應40 min，抽干，洗滌，抽干，茚三酮法檢測若無色，則說明反應完全。

[0017]

（6）在步驟(5)得到的樹脂中，加入脫帽試劑，室溫反應5 min，抽干，重新加入脫

帽劑反應10 min，抽干，洗滌，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均勻液體，

在室溫下反應40 min，抽干，洗滌，抽干，茚三酮法檢測若無色，則說明反應完全。

[0018]

（7）在步驟(6) 得到的樹脂中，加入脫帽試劑，室溫反應5 min，抽干，重新加入脫

帽劑反應10 min，抽干，洗滌，加入正辛酸、DMF、DIEA及HBTU的混和均勻液體，在室溫下反

應40 min，抽干，洗滌，抽干，茚三酮法檢測若無色，則說明反應完全。用DCM重新洗滌兩次，

樹脂真空干燥。

[0019]

（8）把干燥后的樹脂倒入玻璃的茄形瓶中，冰浴降溫，加入切割試劑（81.5%

TFA+1%TIS+5%DIWater +2.5%EDT +5%苯甲硫醚 +5%苯酚）攪拌反應10 min后室溫攪拌3-4

h。過濾除去樹脂，加乙醚沉淀，離心，乙醚洗滌，得到的固體減壓抽干，即得粗品。粗品經制

備HPLC純化，冷凍干燥，得到純品。

[0020]

3、根據權利要求2所述的一種低溶血性抗菌脂肽的制備方法，其特征在于：脫帽

試劑組分和體積比為：哌啶：DMF=1：4；Fmoc-Trp(Boc)-OH的摩爾數為樹脂的2-4倍；HBTU

的摩爾數為樹脂的2-4倍；DIEA的摩爾數為樹脂的2-6倍；Fmoc-Pro-OH的摩爾數為樹脂

的2-4倍；Fmoc- Lys(Boc)-OH的摩爾數為樹脂的2-4倍；Fmoc- Phe-OH的摩爾數為樹脂的

2-4倍；正辛酸的摩爾數為樹脂的2-4倍。

4、根據權利要求2所述的一種低溶血性抗菌脂肽的制備方法，其特征在于：Fmoc

Rink-Amide MBHA樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5-15 mL/g；Fmoc Rink-Amide

MBHA樹脂的重量與DMF的加入量的比例為5-12 mL/g；Fmoc Rink-Amide MBHA樹脂的重量

與DMF、無水甲醇、DCM的加入量的比例為5-12 mL/g。

[0022]

5、根據權利要求1所述抗菌脂肽在制備抗菌藥物中的應用。

[0023]

6、根據權利要求1所述的抗菌脂肽，其特征在于：其衍生物或活性片段包含權利

[0021]

5

CN 102311483 A

CN 102311484 A

說 明 書

3/4頁

要求1所述的氨基酸序列或片段。

[0024]

7、根據權利要求1所述的脂肽可以應用于食品、化妝品，可以與藥學上可接受的

載體混合，制成注射劑、口服制劑、透皮吸收制劑、黏膜吸收劑等。

附圖說明

[0025]

圖1 為本發明抗菌脂肽Octanoly(C8)-KKKWPW對人的紅血球的低溶血性實驗結

果。

具體的實施方式

實施例1：稱取15g Fmoc Rink-Amide MBHA樹脂置于250ml固相反應器中，用大120ml

的DCM(二氯甲烷)充分溶脹30 min后真空泵抽干，加入100ml DMF(N,N-二甲基甲酰

胺)洗滌樹脂兩次，然后將脫帽試劑放入固相反應器反應5 min，用真空泵抽干，重新加

入脫帽劑反應10 min，用真空泵抽干，分別用100ml DMF、100ml 無水甲醇、100ml DCM洗

滌樹脂兩次，接著用茚三酮法檢測至樹脂成黑色或紫色。然后樹脂用DMF潤洗一次，加入

Fmoc-Trp(Boc)-OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均勻液體，在室溫下反應40 min，真空泵抽干，

分別用DMF、無水甲醇、DCM洗滌，取少量樹脂用茚三酮法檢測若無色，則說明反應完全。

[0027]

在得到的樹脂中，加入脫帽試劑，室溫反應5 min，抽干，重新加入脫帽劑反應10

min，抽干，洗滌，加入Fmoc-Pro-OH、DMF、DIEA及HBTU的混和均勻液體，在室溫下反應40

min，抽干，洗滌，抽干，茚三酮法檢測若無色，則說明反應完全。

[0028]

在上述得到的樹脂中，加入脫帽試劑（60ml 20%哌啶/DMF），室溫反應5 min，抽

干，重新加入脫帽劑反應10 min，抽干，洗滌，加入1.5eq Fmoc- Trp(Boc)-OH、60ml DMF、

DIEA（2.5eq）及HBTU（1.5eq）的混和均勻液體，在室溫下反應40 min，抽干，洗滌，抽干，

茚三酮法檢測若無色，則說明反應完全。

[0029]

重復上述步驟依次加入Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、

Fmoc-Lys(Boc)-OH進行偶聯及Fmoc脫除。全部肽序列偶聯完成的樹脂依次加

入DMF（100ml）、MeOH（100ml）、DCM（100ml），洗滌完成后放置于真空干燥箱中

干燥過夜。干燥后的樹脂倒入玻璃的茄形瓶中，冰浴降溫，加入切割試劑（81.5%

TFA+1%TIS+5%DIWater+2.5%EDT+5%苯甲硫醚+5%苯酚）攪拌反應10 min后室溫攪拌3-4

h。過濾除去樹脂，加乙醚沉淀，離心，乙醚洗滌，得到的固體減壓抽干，即得粗品。粗品經制

備HPLC純化，冷凍干燥，得到純品。所使用的反相高效液相層析是半制備C18反相柱。純

化的流動相是不同比例的乙腈和水的混合。波長220和280納米檢測。流速是4毫升/分

鐘。所得的主要勝肽產物以液質聯用儀（LC-MS）確定分子量。

[0030]

實施例2：體外抗菌活性測試

將倍比稀釋后不同濃度的抗菌脂肽溶液分別加到滅菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至

第11孔加藥液，每孔10μl，第12孔不加藥作為生長對照。將用生長法或直接菌懸液法制

備的濃度相當于0.5麥氏比濁標準的菌懸液，經MH（Meuller-Hinton）肉湯1∶1000稀釋

后，向每孔中加100μl，密封后置35℃普通空氣孵箱中，孵育16~20h判斷結果。以在小孔

內完全抑制細菌生長的最低藥物濃度為MIC。當陽性對照孔（即不含抗生素）內細菌明顯生

長試驗才有意義。重復試驗3次，求得平均值，如表一。根據結果，發現本發明的抗菌肽及

其衍生的短肽具有很強的抗菌活性。

[0026]

6

CN 102311483 A

CN 102311484 A

[0031]

說 明 書

4/4頁

表一 抗菌脂肽對不同菌株的最小抑制濃度（μg/ml）

大腸桿菌

10

10

20

20

金黃葡萄球菌

10

20

20

20

枯草桿菌

10

20

20

20

綠膿桿菌

20

20

20

20

抗菌脂肽序列

Octanoly(C8)-KKKWPW

Octanoly(C8)-KKK

Octanoly(C8)-KKKW

Octanoly(C8)-KKKWP

實施例3：溶血實驗

采取人的血液，加入肝素（每10ml血加1%肝素1ml）混合，放入離心機中，800g離心 5

分鐘，取出后棄去上清液。加入生理鹽水混合后再離心，后除去上清液。同法重復一次，得

洗滌紅細胞，用生理鹽水配成10%混懸液以每管50微升的體積分裝備用。將溶解于生理鹽

水中的抗菌脂肽加入，37℃培養一小時（最后紅血球濃度為5% V/V）。800g離心10分鐘，將

前處理過的紅血球和不同濃度的抗菌脂肽培養而分別得到其溶血性百分比。結果（表二）顯

示，本發明的抗菌脂肽對于人的紅血球有較低的溶血性。

[0032]

表二 抗菌脂肽的溶血百分比測定（%）

抗菌脂肽序列

Octanoly(C8)-KKKWPW

Octanoly(C8)-KKK

Octanoly(C8)-KKKW

Octanoly(C8)-KKKWP

5μg/ml

1.20

1.15

1.33

1.18

20μg/ml

2.8

100μg/ml

5tt

500μg/ml

12

11

15

17

3.5 11

6.0 12

6.6 11

以上描述了本發明的優選實施方案，并非用于限定本發明。本領域技術人員對在此公

開的實施方案可以進行不偏離本發明范疇和精神的改進和變化。

7

CN 102311483 A

CN 102311484 A

序 列 表

1/1頁

＜110＞ 大連伊美生物科技有限公司

＜120＞ 一種低溶血性抗菌脂肽及其制備方法

＜130＞

＜160＞ 4

＜170＞

＜210＞ 1

＜211＞ 3

＜212＞ PRT

＜213＞ 人工序列

＜400＞ 1

Lys Lys Lys

＜210＞ 2

＜211＞ 4

＜212＞ PRT

＜213＞ 人工序列

＜400＞ 2

Lys Lys Lys Trp

＜210＞ 3

＜211＞ 5

＜212＞ PRT

＜213＞ 人工序列

＜400＞ 3

Lys Lys Lys Trp Pro

＜210＞ 4

＜211＞ 6

＜212＞ PRT

＜213＞ 人工序列

＜400＞ 4

Lys Lys Lys Trp Pro Trp

8

CN 102311483 A

CN 102311484 A

說 明 書 附 圖

1/1頁

圖1

9