表面等離子共振技術(shù),英文簡(jiǎn)寫SPR,是從20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一種新技術(shù),其應(yīng)用SPR原理檢測(cè)生物傳感芯片(bionsor?chip)上配位體與分析物之間的相互作用情況,廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。
中文名表面等離子共振
外文名Surface?Plasmon?Resonance
性 質(zhì)物理技術(shù)
縮 寫SPR
背景簡(jiǎn)介1902年,Wood在一次光學(xué)實(shí)驗(yàn)中,首次發(fā)現(xiàn)了SPR現(xiàn)象并對(duì)其做了簡(jiǎn)單的記錄,但直到39年后的1941年,一位名叫Fano的科學(xué)家才真正解釋了SPR現(xiàn)象。之后的30年間,SPR技術(shù)并沒有實(shí)質(zhì)的發(fā)展,也沒能投入到實(shí)際應(yīng)用中去。1971年Kretschmann為SPR傳感器結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ),也拉開了應(yīng)用SPR技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的序幕。1983年,Liedberg首次將SPR用于IgG與其抗原的反應(yīng)測(cè)定并取得了成功。1987年,Knoll等人開始研究SPR的成像。到了1990年,Biacore?AB公司開發(fā)出了首臺(tái)商品化SPR儀器,為SPR技術(shù)更加廣泛的應(yīng)用開啟了新的樂章。簡(jiǎn)言之,SPR是用來進(jìn)行實(shí)時(shí)分析,簡(jiǎn)單快捷的監(jiān)測(cè)DNA與蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間、藥物與蛋白質(zhì)之間、核酸與核酸之間、抗原與抗體之間、受體與配體之間等等生物分子之間的相互作用。SPR在生命科學(xué)、醫(yī)療檢測(cè)、藥物篩選、食品檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、毒品檢測(cè)以及法醫(yī)鑒定等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用需求。
原理介紹消逝波
全反射根據(jù)法國(guó)物理學(xué)家菲涅爾所提出的光學(xué)定理:??可知,當(dāng)光從光密介質(zhì)射入光疏介質(zhì),入射角增大到某一角度,使折射角達(dá)到90°時(shí),折射光將完全消失,而只剩下反射光,這種現(xiàn)象叫做全反射。(圖1)當(dāng)以波動(dòng)光學(xué)的角度?來研究全反射時(shí),人們發(fā)現(xiàn)當(dāng)入射光到達(dá)界面時(shí)并不是直接產(chǎn)生反射光,而是先透過光疏介質(zhì)約一個(gè)波長(zhǎng)的深度,再沿界面流動(dòng)約半個(gè)波長(zhǎng)再返回光密介質(zhì)。則透過光疏介質(zhì)的波被稱為消逝波。
等離子波
等離子體通常指由密度相當(dāng)高的自由正、負(fù)電荷組成的氣體,其中正、負(fù)帶電粒子數(shù)目幾乎相等。把金屬表面的價(jià)電子看成是均勻正電荷背景下運(yùn)動(dòng)的電子氣體,這實(shí)際上也是一種等離子體。當(dāng)金屬受電磁干擾時(shí),金屬內(nèi)部的電子密度分布會(huì)變得不均勻。因?yàn)閹?kù)侖力的存在,會(huì)將部分電子吸引到正電荷過剩的區(qū)域,被吸引的電子由于獲得動(dòng)量,故不會(huì)在引力與斥力的平衡位置停下而向前運(yùn)動(dòng)一段距離,之后電子間存在的斥力會(huì)迫使已經(jīng)聚集起來的電子再次離開該區(qū)域。由此會(huì)形成一種整個(gè)電子系統(tǒng)的集體震蕩,而庫(kù)侖力的存在使得這種集體震蕩反復(fù)進(jìn)行,進(jìn)而形成的震蕩稱等離子震蕩,并以波的形式表現(xiàn),稱為等離子波。
SPR光學(xué)原理
SPR?技術(shù)示意圖我們?cè)谇懊嫣岬焦庠诶忡R與金屬膜表面上發(fā)生全反射現(xiàn)象時(shí),會(huì)形成消逝波進(jìn)入到光疏介質(zhì)中,而在介質(zhì)(假設(shè)為金屬介質(zhì))中又存在一定的等離子波。當(dāng)兩波相遇時(shí)可能會(huì)發(fā)生共振。當(dāng)消逝波與表面等離子波發(fā)生共振時(shí),檢測(cè)到的反射光強(qiáng)會(huì)大幅度地減弱。能量從光子轉(zhuǎn)移到表面等離子,入射光的大部分能量被表面等離子波吸收,使反射光的能量急劇減少。
可以從左側(cè)的反射光強(qiáng)響應(yīng)曲線看到一個(gè)最小的尖峰,此時(shí)對(duì)應(yīng)的入射光波長(zhǎng)為共振波長(zhǎng),對(duì)應(yīng)的入射角θ為SPR角。電子吸收光能量,從而使反射光強(qiáng)在一定角度時(shí)大大減弱,其中是反射光完全消失的角就是SPR角。SPR角隨金表面折射率變化而變化,而折射率的變化又與金表面結(jié)合的分子質(zhì)量成正比。因此可以通過對(duì)生物反應(yīng)過程中SPR角的動(dòng)態(tài)變化獲取生物分子之間相互作用的特異信號(hào)。
生物分子相互作用分析基于SPR原理
生物分子相互作用分析是基于SPR原理的新型生物傳感分析技術(shù),無須進(jìn)行標(biāo)記,也可以無須純化各種生物組分。在天然條件下通過傳感器芯片實(shí)時(shí)、原位和動(dòng)態(tài)測(cè)量各種生物分子如多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、寡聚糖,以及病毒、細(xì)菌、細(xì)胞、小分子化合物之間的相互作用過程。表面等離子共振是表面增強(qiáng)拉曼的重要增強(qiáng)機(jī)理之一,由于貴金屬納米粒子的尺寸效應(yīng)及量子效應(yīng)通過激發(fā)光照射能引起表面等離子共振,從而大大增強(qiáng)拉曼散射信號(hào),已達(dá)到痕量檢測(cè)的目的。
應(yīng)用操作綜合運(yùn)用
表面等離子共振廣泛應(yīng)用于研究結(jié)合特異性、抗體選擇、抗體質(zhì)控、疾病機(jī)制、藥物發(fā)明、生物治療、生物處理、生物標(biāo)記物、配體垂釣、基因調(diào)控、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、親和層析、結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系、小分子間相互作用等。
檢測(cè)原理
表面等離子共振(SPR)是一種光學(xué)現(xiàn)象,可被用來實(shí)時(shí)跟蹤在天然狀態(tài)下生物分子間的相互作用。這種方法對(duì)生物分子無任何損傷,且不需任何標(biāo)記物。
先將一種生物分子(靶分子)鍵合在生物傳感器表面,再將含有另一種能與靶分子產(chǎn)生相互作用的生物分子(分析物)的溶液注入并流經(jīng)生物傳感器表面。生物分子間的結(jié)合引起生物傳感器表面質(zhì)量的增加,導(dǎo)致折射指數(shù)按同樣的比例增強(qiáng),生物分子間反應(yīng)的變化即被觀察到。這種反應(yīng)用反應(yīng)單位(RU)來衡量:1?RU?=?1pg?蛋白/mm2?=?1?x?10-6?RIU(折射指數(shù)單位)。
分析物在被注入的過程中,由對(duì)流和擴(kuò)散流經(jīng)相互作用表面而與靶分子形成復(fù)合物,導(dǎo)致分析物濃度改變。微射流系統(tǒng)內(nèi)nL數(shù)量級(jí)流動(dòng)通道的應(yīng)用,使得這種濃度的改變降至最低點(diǎn),以確保高傳質(zhì)系數(shù)(Mass?Transport?Coefficient,km)。為保證分析物的傳質(zhì)性不被限制,鍵合在生物傳感器表面的靶分子濃度必須較低。當(dāng)分析物被注入時(shí),分析物-靶分子復(fù)合物在生物傳感器表面形成,導(dǎo)致反應(yīng)增強(qiáng)。而當(dāng)分析物被注入完畢后,分析物-靶分子復(fù)合物解離,導(dǎo)致反應(yīng)減弱。通過結(jié)合式相互作用模型擬合這種反應(yīng)曲線,動(dòng)力學(xué)常數(shù)便可被確定。而非特異性結(jié)合和總折射指數(shù)移相等效應(yīng)則可通過參照曲線減除功能予以驅(qū)除。
相關(guān)商業(yè)化系統(tǒng)
表面等離子共振已經(jīng)在商業(yè)化的檢測(cè)儀器中應(yīng)用。目前最廣泛使用的是Biacore?Life?Sciences公司生產(chǎn)的Biacore系列。Biacore?Life?Sciences現(xiàn)已被General?Electric收購(gòu)。其它表面等離子共振的商業(yè)儀器還有例如ICx的SensiQ等。
SensiQ的SPR生物傳感器運(yùn)用了Texas?Instruments公司研發(fā)的光學(xué)傳感器設(shè)計(jì),以及Kretschmann?SPR幾何學(xué)構(gòu)建,靈敏度高,光學(xué)靜穩(wěn)。生物傳感器一次性使用,其羧基化表面適合于多種優(yōu)化鍵合方案。生物傳感器的安裝快捷,幾秒鐘便可完成,使用也非常簡(jiǎn)便。功能化的生物傳感器即便在儲(chǔ)存一段時(shí)間后仍可繼續(xù)使用。
SensiQ的雙通道nL數(shù)量級(jí)的流動(dòng)池設(shè)計(jì),利于實(shí)時(shí)的參照曲線減除,并保證分析物在生物傳感器的相互作用表面具有高傳質(zhì)性(Mass?Transport)。
表面等離子共振儀器結(jié)構(gòu)及工作原理表面等離子共振儀核心部件包括光學(xué)系統(tǒng)、傳感器芯片、液體處理系統(tǒng)三個(gè)主要部分,其他的組成部分包括LED狀態(tài)指示器及溫度控制系統(tǒng)等。
光學(xué)系統(tǒng)
能夠產(chǎn)生和測(cè)量SPR信號(hào)的光電組分稱為光學(xué)檢測(cè)單元。
傳感器芯片
傳感器的芯片是其最為核心的部件。在SPR技術(shù)中必須首先有一個(gè)生物分子偶聯(lián)在傳感片上,然后用它去捕獲可與之進(jìn)行特異反應(yīng)的生物分子。
傳感芯片又分為三個(gè)主要組成部分,分別是光波導(dǎo)耦合器件、金屬膜以及分子敏感膜。
液體處理系統(tǒng)
液體處理系統(tǒng)包括兩個(gè)液體傳送泵,其中一個(gè)泵負(fù)責(zé)保持穩(wěn)定流速的液體流過傳感芯片表面,另一個(gè)泵負(fù)責(zé)自動(dòng)自動(dòng)進(jìn)樣裝置中的樣品傳送。
其他部分
包括例如LED狀態(tài)指示器和溫度控制系統(tǒng)等。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原料
親和分子對(duì)包括:
蛋白質(zhì)–蛋白質(zhì)(Protein–Protein)
多肽–受體(Peptide–Receptor)
抗體–抗原(Antibody–Antigen)
膜受體–配體(Membrane?Receptor–Ligand)
凝集素–聚糖/糖蛋白(Lectin–Polysacharride/Glycoprotein)
蛋白質(zhì)–小分子(Protein–Small?Molecule)
蛋白質(zhì)–核酸(Protein–Nucleic?Acid)
細(xì)胞–配體(Cell–Ligand)
調(diào)和方法
任何一對(duì)親和分子,一個(gè)(靶分子)被鍵合在生物傳感器表面,另一個(gè)(分析物)被置于溶液中。當(dāng)含有分析物的溶液流經(jīng)靶分子鍵合的生物傳感器表面時(shí),親和性復(fù)合物生成。
SensiQ配備雙通道流動(dòng)注射分析式微射流系統(tǒng),內(nèi)有85nL流動(dòng)池。SensiQ使用一次性的SPR生物傳感器,裝卸簡(jiǎn)便。生物傳感器表面包被有單層的羧基化寡聚環(huán)氧乙烷(Carboxylated?Oligoethyleneoxide)基質(zhì),可鍵合多種生物分子,并有效地阻止非特異性結(jié)合及變性。靶生物分子的這種既被鍵合在固相生物傳感器表面,又存在于液相中的方式,增進(jìn)了兩種親和分子間的接觸性,同時(shí)避免了由于人為因素所造成的動(dòng)力學(xué)分析的復(fù)雜化。
SensiQ備有多種鍵合方案用于改進(jìn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),以支持生物分子的附著。最常用的偶聯(lián)方式是用EDC/NHS進(jìn)行胺偶聯(lián)。其它鍵合方式,例如順丁烯二酰亞胺-硫醇(Maleimide-thiol),還原胺化,酰肼-醛(Hydrazide-aldehyde),親和力捕獲等,亦可使用。SensiQ雙通道檢測(cè)中的一個(gè)通道可用于生成適當(dāng)?shù)膮⒄涨€。當(dāng)表面化學(xué)物固定好以后,加入最多250?μl的樣品,緩沖液流經(jīng)生物傳感器表面時(shí)產(chǎn)生穩(wěn)定的基線。樣品注入和計(jì)時(shí)通過自動(dòng)化控制完成。通過實(shí)驗(yàn)設(shè)置向?qū)Чδ埽脩艨捎涗浂啻巫⑸渲芷冢⒕邆涓咧貜?fù)性。
軟件控制軟件
SensiQ的控制軟件在原始反應(yīng)曲線生成時(shí),同時(shí)并實(shí)時(shí)獲取和展示兩個(gè)通道內(nèi)的數(shù)據(jù)。參照通道內(nèi)的數(shù)據(jù)被減除,以補(bǔ)償熱漂移、非特異性結(jié)合、總折射指數(shù)移相等效應(yīng),從而得到清晰高質(zhì)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。控制軟件在反應(yīng)曲線上簡(jiǎn)單加入報(bào)告點(diǎn),用來確定樣品注入后產(chǎn)生的結(jié)合反應(yīng)。報(bào)告點(diǎn)的添加可在實(shí)驗(yàn)中的任何時(shí)候由人工進(jìn)行,或由程序預(yù)設(shè)在固定的實(shí)驗(yàn)周期之中。列于表格中的所有報(bào)告點(diǎn),連同相關(guān)的事件紀(jì)錄,均有案可查。數(shù)據(jù)文件被儲(chǔ)存后可被控制軟件重新打開并編輯。
SensiQ控制軟件的簡(jiǎn)單明了的用戶界面,使得實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和進(jìn)行高效省時(shí)。實(shí)驗(yàn)向?qū)Чδ芎?jiǎn)化設(shè)置過程,提高實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。
QDATTM分析軟件
反應(yīng)曲線的分析以及其后的動(dòng)力學(xué)和親和性數(shù)據(jù)測(cè)算通常繁瑣費(fèi)時(shí)。SensiQ的QDATTM分析軟件極大地簡(jiǎn)化了數(shù)據(jù)分析過程,為研究人員的動(dòng)力學(xué)和親和性測(cè)定提供了簡(jiǎn)單、省時(shí)、可信的手段。
QDATTM是在Biologic?Software公司應(yīng)用廣泛的Clamp?and?Scrubber架構(gòu)之上開發(fā)的最新一代分析軟件,可在幾分鐘內(nèi)成功分析采集到的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。QDATTM的簡(jiǎn)明友好界面帶領(lǐng)用戶通過一系列步驟,幾秒鐘內(nèi)便完成信息的測(cè)算。QDATTM的模型擬合運(yùn)用數(shù)字整合及優(yōu)化的曲線擬合算法,迅速地估算最佳擬合參數(shù)值,確保相互作用模型和數(shù)據(jù)集的擬合,以測(cè)定動(dòng)力學(xué)和親和性常數(shù),以及濃度分析。QDATTM同時(shí)提供了簡(jiǎn)單殘差圖和殘差標(biāo)準(zhǔn)差,用來定量評(píng)估擬合的程度。QDATTM的動(dòng)力學(xué)擬合模型包括準(zhǔn)一級(jí)結(jié)合模型(Pudo-first-order?Binding?Model)和準(zhǔn)一級(jí)傳質(zhì)結(jié)合模型(Pudo-first-order?Binding?Model?with?Mass?Transport)。
技術(shù)參數(shù)一次性生物傳感器
流動(dòng)池?cái)?shù)量2
流動(dòng)池選擇1,或2,或1和2
流動(dòng)池面積2.2?mm2
流動(dòng)池容積85?nL(高傳質(zhì)率)
樣品加入手動(dòng)(注射器)
樣品注入自動(dòng)電腦控制人工電腦控制
樣品雙通道同時(shí)注入
樣品注入體積10–250?μL
樣品注射泵內(nèi)置式外接式
樣品流動(dòng)速率5–150?μL?/分自定(<?250?μL?/分)
內(nèi)部死體積<?1.5?μL
實(shí)時(shí)參照曲線減除
折射指數(shù)范圍1.32–1.401.33–1.40
短期背景噪音<?0.25?RU<?1?RU
長(zhǎng)期背景噪音<?0.30?RU/分(當(dāng)環(huán)境變化?<?3°C?/小時(shí))
溫度控制15–40°C室溫
尺寸(W?x?H?x?D)35.0?x?34.2?x?38.8?cm22.9?x?15.2?x?27.9?cm
重量15.9?kg3.6?kg
電源100–240?V,50/60?Hz
工作范圍
分子量低限<?200?Da<?250?Da
ka(結(jié)合速率常數(shù))?1?x?107?M–1s–1
kd(解離速率常數(shù))10–6–10–1?s–1
KD(kd?/?ka)10–4–10–10?M
濃度<?10–10–10–3?M
傳感化學(xué)胺基偶聯(lián)固定
(COOH1和COOH2芯片)
由于胺基基團(tuán)的普遍性,所以通過胺基偶聯(lián)固定配體適用于絕大部分的生物分子。到目前我們發(fā)現(xiàn)這種方法將配體隨機(jī)固定,通常得到高質(zhì)量的結(jié)果。因此通過沒必要直接固定特定位點(diǎn)。
最常用的方法是使用NHS和EDC含水混合物活化羧基產(chǎn)生胺基活性脂。這個(gè)流程有以下的幾個(gè)好處:
無需衍生作用,無需標(biāo)簽,可以固定絕大多數(shù)生物分子
產(chǎn)生大量穩(wěn)定的共價(jià)鍵,以防止配體從表面濾掉
在廣泛的pH值中是非常有效的
生物分子無需暴露在惡劣的條件中
很容易控制固定條件,可以防止與表面過度交叉連鎖
化學(xué)試劑制備,凍存數(shù)月
親和力捕獲表面組氨酸標(biāo)簽蛋白
(HisCap和HisHiCap芯片)
ICx?Nomadics公司的HisCap芯片使聚組氨酸標(biāo)簽蛋白的固定穩(wěn)定、可逆,也讓表面等離子共振(SPR)實(shí)驗(yàn)更加簡(jiǎn)單。連有固定蛋白的基線非常穩(wěn)定,可以做動(dòng)力學(xué)分析實(shí)驗(yàn)。
HisCap芯片:
提供一個(gè)直接固定His-tagged蛋白的最便利的手段。
也可以適用于任何帶有足夠數(shù)量的組氨酸殘基的蛋白。
HisCap芯片采用Hoffman-LaRoche研發(fā)建立的NTA-Ni技術(shù)來附著蛋白質(zhì)。在這種技術(shù)中,感興趣蛋白質(zhì)的組氨酸的側(cè)鏈咪唑與表面附著的NTA-Ni復(fù)合物共協(xié)作,如圖所示。只要蛋白質(zhì)有足夠的組氨酸,這種技術(shù)就非常有效。典型的組氨酸標(biāo)簽是6個(gè)組氨酸,但是3個(gè)也可以。
HisCap芯片優(yōu)勢(shì):
在實(shí)驗(yàn)室的重組蛋白工作中,His-tagging是一個(gè)長(zhǎng)期建立的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。
利用HisCap芯片捕獲His-tagged蛋白產(chǎn)生穩(wěn)定的基線。
在溫和的條件,可以再生芯片。例如EDTA或者咪唑。
可重復(fù)使用HisCap芯片。
囊泡捕獲膜受體相互作用
(VesCap芯片)
利用ICX囊泡捕獲(VesCap)芯片可以研究分子與細(xì)胞膜、脂質(zhì)體的相互作用,進(jìn)行實(shí)時(shí)、無標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)。在VesCap芯片中,脂雙層好像在自然細(xì)胞環(huán)境中,自身構(gòu)造中的各種細(xì)胞膜組分可以在細(xì)胞膜真實(shí)模型中自由混合。我們還不能確認(rèn)囊泡溶入單膜雙層,但是這在二維表面是極其可能。
一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)?zāi)P蛻?yīng)包含藥物、毒素以及在細(xì)胞信號(hào)中所涉及的周邊膜關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)
膜蛋白和伴生蛋白只在真實(shí)的細(xì)胞膜中相互作用
可以固定著床在脂質(zhì)體的受體/配體
VesCap芯片性質(zhì):
脂雙層和膜蛋白的自身結(jié)構(gòu)依保持不變。在傳感器表面的囊泡捕獲是非共價(jià)的,允許任意方向上的膜組分自由融合。
PEG-正葵胺層展示出一個(gè)簡(jiǎn)單的二維相互作用平面。
附著在表面的囊泡、脂類體的制備很簡(jiǎn)單。
VesCap化學(xué)特別適合一個(gè)過度表達(dá)表面受體的細(xì)胞系
VesCap芯片的再生很簡(jiǎn)單。表面活化劑和溶劑的組合清除VesCap芯片表面所有的囊泡,從而再生VesCap芯片。
親和素-生物素固定
(BioCap和AvCap芯片)
通過親和素-生物素為基礎(chǔ)的方法固定生物分子,操作簡(jiǎn)單、效果出色,在今天仍然廣受研究人員的歡迎。利用了這個(gè)技術(shù),BioCap芯片和AvCap芯片可靠固定配體。示意圖如下描繪了這兩種固定方法。主要優(yōu)勢(shì)在于:
不依賴于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)
只需要少量配體
可商業(yè)獲取,廣泛的生物素試劑
生物素試劑盒操作簡(jiǎn)單
固定只需要簡(jiǎn)單的注射
當(dāng)所需的Rmax達(dá)到時(shí),停止注射可以精確的控制固定結(jié)合物的濃度
相對(duì)于COOH芯片,表面具有很低的靜電電荷
一個(gè)生物素反應(yīng)通常產(chǎn)生足夠產(chǎn)物,可以無限量的固定。
SPR技術(shù)特點(diǎn)SPR?光學(xué)生物傳感器經(jīng)過?20?年來的發(fā)展?,?已經(jīng)成為生命科學(xué)和制藥領(lǐng)域的一種重要的研究工具。與傳統(tǒng)的相互作用技術(shù)如超速離心,熒光法,熱量測(cè)定法等相比,SPR生物傳感器具有如下顯著特點(diǎn):
隨著?SPR?技術(shù)成為分析生物化學(xué)、藥物研發(fā)和食物監(jiān)控領(lǐng)域中的一個(gè)不可缺少的部分?,SPR?生物傳感器的應(yīng)用將更加趨向多樣化?,?特別是它在小分子檢測(cè)和脂膜領(lǐng)域的新興應(yīng)用將使其在未來的藥物發(fā)現(xiàn)和膜生物學(xué)中扮演一個(gè)越來越重要的角色。?近幾年?,?其發(fā)展尤為迅猛?,?隨著?SPR?儀器的不斷完善和生物分子膜構(gòu)建能力的不斷增強(qiáng)?,SPR?生物傳感器的應(yīng)用前景極為廣闊。
參考資料本文發(fā)布于:2023-06-01 15:33:05,感謝您對(duì)本站的認(rèn)可!
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