酵母雙雜交（生物術語）

酵母雙雜交（生物術語）

酵母雙雜交 （生物術語） 次瀏覽 | 2022.08.25 09:00:45 更新 來源 ：互聯網 精選百科 本文由作者推薦 酵母雙雜交生物術語

酵母雙雜交系統由Fields和Song等首先在研究真核基因轉錄調控中建立。

酵母雙雜交系統(yeasttwo-hybridsystem)是一種直接于酵母細胞內檢測蛋白質-蛋白質相互作用而且靈敏度很高的分子生物學方法。該系統在1989年有Fields和Song等在研究真核基因轉錄調控中首次建立并得到廣泛的應用。此項技術的出現使以往因耗時、繁瑣的物理測定和基因篩選限制而無法實現的許多設想，都可能逐一實現，酵母雙雜交系統是鑒定及分析蛋白質-蛋白質間相互作用的最常用及最有效的工具之一，此技術現已逐漸推廣到了如信號傳導、細胞周期調控及基因表達調控等多個領域。

中文名

酵母雙雜交系統

提出者

Fields和Song

提出時間

1989年

特點

快速直接

新功能

發現新基因

遇到問題

假陽性較多、轉化效率偏低

基本思想

酵母雙雜交由Fields在1989年提出。他的產生是基于對真核細胞轉錄因子特別是酵母轉錄因子GAL4性質的研究。GAL4包括兩個彼此分離的但功能必需的結構域。位于N端1-147位氨基酸殘基區段的DNA結合域（DNAbindingdomain，DNA-BD）和位于C端768-881位氨基酸殘基區段的轉錄激活域（Activationdomain,AD)。

DNA-BD能夠識別位于GAL4效應基因（GAL4responsivegene）的上游激活序列(Upstreamactivatingquence,UAS)，并與之結合。而AD則是通過與轉錄機構（transcriptionmachinery）中的其他成分之間的結合作用，以啟動UAS下游的基因進行轉錄。DNA-BD和AD單獨分別作用并不能激活轉錄反應，但是當二者在空間上充分接近時，則呈現完整的GAL4轉錄因子活性并可激活UAS下游啟動子，使啟動子下游基因得到轉錄。

Fields建立了一個雙雜交系統，BD與X蛋白融合，AD與Y蛋白融合，如果X、Y之間形成蛋白-蛋白復合物，使GAL4兩個結構域重新構成，則會啟動特異基因序列的轉錄。他們利用Snf1與Snf4的相互作用，將Snf1與BD融合，Snf4與AD融合，構建在穿梭質粒上。其中Snf1是一種依賴于絲氨酸、蘇氨酸的蛋白激酶，Snf4是他的一個結合蛋白。

研究者將二種穿梭質粒轉化酵母GGY：171菌株，該菌株含有LacZ報告基因，并已去除相應轉錄因子基因。該實驗的結果表明由Snf1和Snf4相互作用使得AD和BD在空間上接近，激活了報告基因LacZ的轉錄。一般地，將BD-X的融合蛋白稱作誘餌（bait),X往往是已知蛋白，AD-Y稱作獵物（prey），能顯示誘餌和獵物相互作用的基因稱報告基因，通過對報告基因的檢測，反過來可判斷誘餌和獵物之間是否存在相互作用。

基本原理

雙雜交系統的建立得力于對真核生物調控轉錄起始過程的認識。細胞起始基因轉錄需要有反式轉錄激活因子的參與。80年代的工作表明，轉錄激活因子在結構上是組件式的（modular）,即這些因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結構域構成,其中有DNA結合結構域（DNAbindingdomain，簡稱為BD）和轉錄激活結構域（activationdomain，簡稱為AD），它們是轉錄激活因子發揮功能所必需的。

前者可識別DNA上的特異序列，并使轉錄激活結構域定位于所調節的基因的上游，轉錄激活結構域可同轉錄復合體的其他成分作用，啟動它所調節的基因的轉錄。

兩個結構域不但可在其連接區適當部位打開，仍具有各自的功能。而且不同兩結構域可重建發揮轉錄激活作用。酵母雙雜交系統利用雜交基因通過激活報道基因的表達探測蛋白－蛋白的相互作用。

單獨的BD雖然能和啟動子結合，但是不能激活轉錄。而不同轉錄激活因子的BD和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉錄的功能。如酵母細胞的Gal4蛋白的BD與大腸桿菌的一個酸性激活結構域B42融合得到的雜合蛋白仍然可結合到Gal4結合位點并激活轉錄。

主要有二類載體：a含DNA-bindingdomain的載體；b含DNA-activatingdomain的載體。一般編碼一個蛋白的基因融合到明確的轉錄調控因子的DNA－結合結構域(如GAL4-bd，LexA-bd）；另一個蛋白的基因融合到轉錄激活結構域（如GAL4-ad，VP16）。上述二類載體在構建融合基因時，測試蛋白基因與結構域基因必須在閱讀框內融合。

融合基因在報告株中表達，其表達產物只有定位于核內才能驅動報告基因的轉錄。例如GAL4-bd具有核定位序列（nuclear-localizationquence），而GAL4-ad沒有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端應克隆來自SV40的T-抗原的一段序列作為核定位的序列。目前研究中常用binding-domain基因有：GAL4（1-147）;LexA(Ecoli轉錄抑制因子）的DNA-bd編碼序列。常用的activating-domain基因有：GAL4（768-881）和皰疹病毒VP16的編碼序列等。

雙雜交系統的另一個重要的元件是報道株。報道株指經改造的、含報道基因（reportergene）的重組質粒的宿主細胞。最常用的是酵母細胞，酵母細胞作為報道株的酵母雙雜交系統具有許多優點：

〈1〉易于轉化、便于回收擴增質粒。〈2〉具有可直接進行選擇的標記基因和特征性報道基因。〈3〉酵母的內源性蛋白不易同來源于哺乳動物的蛋白結合。激活結構域融合基因轉入表達結合結構域融合基因的酵母細胞系中，蛋白間的作用使得轉錄因子重建導致相鄰的報道基因表達（如lacZ），從而可分析蛋白間的結合作用。

酵母雙雜交系統能在體內測定蛋白質的結合作用，具有高度敏感性。

主要是由于：

①采用高拷貝和強啟動子的表達載體使雜合蛋白過量表達。②信號測定是在自然平衡濃度條件下進行，而如免疫共沉淀等物理方法為達到此條件需進行多次洗滌，降低了信號強度。③雜交蛋白間穩定度可被激活結構域和結合結構域結合形成轉錄起始復合物而增強，后者又與啟動子DNA結合，此三元復合體使其中各組分的結合趨于穩定。④通過mRNA產生多種穩定的酶使信號放大。同時，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表達等檢測方法均很敏感。

文庫篩選

將待測基因與Gal4或LexA或其他合適蛋白的DNA結合域融合構建誘餌質粒；將誘餌質粒轉化缺

乏報告基因啟動子的酵母細胞株中，選擇被轉化的酵母；再將文庫質粒轉化到酵母中。

通過報告基因的功能篩選相互作用的蛋白，從酵母中分離質粒然后轉化E。coli，從大腸桿菌中提取質粒并測序，在數據庫中比對所測定序列與已知蛋白的同源性。

結構組成

酵母雙雜交系統可應用于確定兩已知有生理作用的蛋白間的作用位點或結構域。

利用此系統已分析和測定了多種重要結構域，如p85三磷酸肌醇激酶和p110亞單位作用的結構域v，p21cip1蛋白與增殖細胞核抗原(proliferating-cellnuclearantigen,PCNA)的結合序列等。

此外酵母雙雜交系統還應用于闡明蛋白質相互作用的結構域，繪制蛋白質聯系圖譜，在藥物設計等許多方面。

相關應用

酵母雙雜交系統是在真核模式生物酵母中進行的，研究活細胞內蛋白質相互作用，對蛋白質之間微弱的、瞬間的作用也能夠通過報告基因的表達產物敏感地檢測得到，它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質之間關系的技術。

大量的研究文獻表明，酵母雙雜交技術既可以用來研究哺乳動物基因組編碼的蛋白質之間的互作，也可以用來研究高等植物基因組編碼的蛋白質之間的互作。因此，它在許多的研究領域中有著廣泛的應用。

發現新的蛋白質和蛋白質的新功能

酵母雙雜交技術已經成為發現新基因的主要途徑。當我們將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽性酵母菌株中可以分離得到AD-LIBRARY載體，并從載體中進一步克隆得到隨機插入的cDNA片段，并對該片段的編碼序列在GENEBANK中進行比較，研究與已知基因在生物學功能上的聯系。

另外，也可作為研究已知基因的新功能或多個篩選到的已知基因之間功能相關的主要方法。例如：Engelender等人以神經末端蛋白alpha-synuclein蛋白為誘餌蛋白，利用酵母雙雜交CLONTECHMATCHMARKERSYSTEM3為操作平臺，從成人腦cDNA文庫中發現了與alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并證明了Synphilin-1與alpha-synuclein之間的相互作用與帕金森病的發病有密切相關。

為了研究兩個蛋白之間的相互作用的結合位點，找到影響或抑制兩個蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母雙雜交技術和基因修飾證明了alpha-synuclein的1-65個氨基酸殘基和Synphilin-1的349-555個氨基酸殘基之間是相互作用的位點。研究它們之間的相互作用位點有利于基因治療藥物的開發。

在細胞體內研究抗原和抗體的相互作用

利用酶聯免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技術都是利用抗原和抗體間的免疫反應，可以研究抗原和抗體之間的相互作用，但是，它們都是基于體外非細胞的環境中研究蛋白質與蛋白質的相互作用。

而在細胞體內的抗原和抗體的聚積反應則可以通過酵母雙雜交進行檢測。例如：來源于矮牽牛的黃烷酮醇還原酶DFR與其抗體scFv的反應中，抗體的單鏈的三個可變區A4、G4、H3與抗原之間作用有強弱的差異。

Geert等利用酵母雙雜交技術，將DFR作為誘餌蛋白，編碼抗體的三個可變區的基因分別被克隆在AD-LIBRARY載體上，將BD-BAIT載體和每種AD-LIBRARY載體分別轉化改造后的酵母菌株中，并檢測報告基因在克隆的菌落中的表達活性，從而在活細胞的水平上檢測抗原和抗體的免疫反應。

篩選藥物作用位點及藥物對蛋白相互作用影響

酵母雙雜交的報告基因能否表達在于誘餌蛋白與靶蛋白之間的相互作用。對于能夠引發疾病反應的蛋白互作可以采取藥物干擾的方法，阻止它們的相互作用以達到治療疾病的目的。

例如：Dengue病毒能引起黃熱病、肝炎等疾病，研究發現它的病毒RNA復制與依賴于RNA的RNA聚合酶（NS5）與拓撲異構酶NS3，以及細胞核轉運受體BETA-importin的相互作用有關。

研究人員通過酵母雙雜交技術找到了這些蛋白之間相互作用的氨基酸序列。如果能找到相應的基因藥物阻斷這些蛋白之間的相互作用，就可以阻止RNA病毒的復制，從而達到治療這種疾病的目的。

建立基因組蛋白連鎖圖

眾多的蛋白質之間在許多重要的生命活動中都是彼此協調和控制的。基因組中的編碼蛋白質的基因之間存在著功能上的聯系。通過基因組的測序和序列分析發現了很多新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母雙雜交技術，將所有已知基因和EST序列為誘餌，在表達文庫中篩選與誘餌相互作用的蛋白，從而找到基因之間的聯系，建立基因組蛋白連鎖圖。

對于認識一些重要的生命活動：如信號傳導、代謝途徑等有重要意義。

系統方法及其優化

在雙雜交鑒定過程中要經過兩次轉化，這個工作量是相當大的，特別是尋找新的作用蛋白質的時候尤其如此。而且，酵母細胞的轉化效率比細菌要低約4個數量級。

因此轉化步驟就成為雙雜交技術的瓶頸。Bendixen等人通過酵母接合型的引用，避免了兩次轉化操作，同時又提高了雙雜交的效率。在酵母的有性生殖過程中涉及到兩種配合類型：a接合型和α接合型，這兩種單倍體之間接合（mating）能形成二倍體，但a接合型細胞之間或α接合型細胞之間不能接合形成二倍體。

根據酵母有性生殖的這一特點，他們將文庫質粒轉化α接合型酵母細胞，“誘餌”表達載體轉化a接合型細胞。然后分別鋪篩選平板使細胞長成菌苔（lawn），再將兩種菌苔復印到同一個三重篩選平板上，原則上只有誘餌和靶蛋白發生了相互作用的二倍體細胞才能在此平板上生長。

單倍體細胞或雖然是二倍體細胞但DB融合蛋白和AD融合蛋白不相互作用的都被淘汰。長出來的克隆進一步通過β-半乳糖苷酶活力進行鑒定。這項改進不僅簡化了實驗操作，而且也提高了雙雜交的篩選效率。

Vidal等人發展了所謂的逆雙雜交系統（revertwo-hybridsystem）。這項技術的關鍵是報道基因URA3的引入。URA3基因在這里起到了反選擇的作用,它編碼的酶是尿嘧啶合成的關鍵酶。

該酶能把5-氟乳清酸(5-FOA)轉化成對細胞有毒的物質。

Vidal等人通過改造在URA3基因的啟動子內引入Gal4的結合位點。這個改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的選擇性培養基上只有當“誘餌”和“獵物”相互作用激活URA3基因的表達才能生長。

在含有5-FOA的完全培養基上“誘餌”和“獵物”的相互作用則抑制細胞的生長。然而如果目的蛋白，即與DB或AD融合的蛋白質發生了突變或者由于外加藥物的干擾不再相互作用，URA3基因不表達，則細胞能在含有5-FOA的完全培養基上生長。

通過這種方法，Vidal等人篩選到了轉錄因子E2F1的突變物，這些突變物仍然能結合視網膜母細胞瘤蛋白RB，但是喪失了同另外一種稱為DP1蛋白的結合能力。

結果得到了體外結合實驗的驗證。通過對這些突變蛋白基因的測序，他們發現了新的E2F1同DP1結合的位點。

在某些情況下，在液體培養基中培養不好的菌珠可以在固體培養基上生長得很好。如果誘餌蛋白對酵母細胞是有毒的，可以通過基因重組切掉轉錄激活域，然后重新檢測其是否自激活，但要注意重組也有可能破壞蛋白之間的互作。

一個甚至兩個融合蛋白對酵母細胞有毒。你可以通過重組方法來減輕毒性，同時又能保證蛋白的相互作用。或者使用表達水平較低的載體。也可以在瓊脂平板或濾膜上進行雜交。

但同時必須作雜交對照實驗。酵母雙雜交實驗轉化效率太低，可以采用以下方法解決：

1)檢測一下DNA的純度，如果可以的話，重新用乙醇純化。

2)DNA-BD/誘餌蛋白很可能是有毒的。

3)不適當的培養基，重新配制培養基，并做對照轉化。

4)檢測pGBT9對照載體的轉化效率，放置于SD/–Trp平板上，轉化效率應該在1x105colonies/mgDNA以上。

在雜交中，預轉化的誘餌細胞的數量可能不夠，雜交效率不高。

當對誘餌菌株進行液體培養過夜時，應挑選大的、新鮮的克隆進行培養，經過離心和重懸后，再使用血球計對細胞進行計數。

改進版本

反式轉錄因子抑制（RTA）系統與經典的Y2H相反，誘餌-獵物的互作將抑制轉錄因子激活報告基因。誘餌蛋白X與Gal4的DBD融合后具有轉錄因子的激活活性，另一個蛋白Y與一種轉錄阻礙物（Tup1p）的抑制結構域（RD）融合。

如果兩者可以相互作用，報告基因的轉錄就會被抑制。RTA系統已被用于研究哺乳動物basichelix-loop-helixproteinsMyoD和E12、protooncogenictranscriptionfactorc-Myc與theputativetumorsuppressorproteinBin1蛋白間的相互作用。

同時，該系統還被用于篩選與各種轉錄激活因子的相互作用，如單純性皰疹病毒（HSV-1）調控蛋白VP16，c-Myc及雄性激素受體。

SOS和RAS募集系統(SRSandRRS)是Ras信號通路轉錄的旁路（arebypassingthetranscriptionalreadoutbyusingtheRassignallingpathway），在酵母細胞和哺乳動物中是相似的。

Ras被定位在質膜上，可通過酵母中的Cdc25或哺乳動物中的Sonofvenless(SOS)脒基交換因子進行GDP-GTP的轉換。Ras被激活后會引發下游信號轉導途徑。

此處描述的Y2H系統使用Cdc25-2溫度敏感型酵母菌株，因為Cdc25-2沒有活性，不能激活Ras信號轉導途徑，導致此菌株在高溫（36℃）下不能生長。通過Y2H系統中選擇性激活Ras，可以使其溫度敏感表型消失。

SCINEX-P系統（胞外蛋白間的互作篩選）由Urech等于2003年發布，使我們可以分析ER內的氧化環境中的蛋白互作。該系統利用酵母未折疊蛋白反應（UPR）的信號途徑。

ER中錯誤折疊蛋白的積累會誘導酵母ERI類跨膜蛋白（Ire1p）形成二聚體，后者誘導Hac1p轉錄，其產物可激活分子伴侶的轉錄。

在SCINEX-P系統中，目的蛋白與缺少位于腔內的N末端寡聚化結構域的Ire1p突變蛋白（ΔIre1p）融合。兩種雜合蛋白的互作會引起Ire1p蛋白二聚體的重構，從而激活UPR下游信號轉導過程。

為了檢測蛋白互作，Hac1pUPR元件被引入報告基因的啟動子上。此Y2H系統被成功地用于分析蛋白質二硫鍵異構酶ERp57與鈣聯蛋白間（這兩個蛋白都在ER中折疊）、抗原與抗體間的互作。

由Johnsson和Varshavsky于1994年設計，可用于測定細胞質基質蛋白間的互作檢測；后來又被擴展為膜蛋白間的互作篩選。泛素是一類小蛋白，對于細胞中錯誤折疊的蛋白是十分重要的。

蛋白通過與一個多聚泛素蛋白鏈共價結合被標記為蛋白酶體的降解對象。該鏈將被泛素特異性蛋白酶（USP）首先從蛋白上降解。分裂泛素化Y2H技術基于泛素可分裂為兩個獨立的片段。

已有的研究顯示泛素可分裂為N端（Nub）及C端（Cub），并且這個片段間有親和性，可能自發形成與原泛素類似的蛋白。通過在Nub（NubG,NubA）的點突變（I13GorI13A）可使Nub和Cub的自發組裝無法進行。

在這兩種突變體中，只有兩部分由于NubG/A和Cub互作而被拉到足夠接近的距離時，才能發生有效地結合。重構的分裂化泛素可被USPs識別，然后切掉與CubC端融合的報告蛋白。

最初的系統使用二氫葉酸還原酶作為報告基因，后者產物可通過SDS-PAGE檢測。然而，由于需要使用免疫共沉淀和電泳分離，陽性克隆的鑒定十分不便。

(MbY2H)系統使用人工轉錄因子（LexA-VP16）作為與泛素相連可被水解的報告蛋白，可分析ER膜蛋白間的相互作用。一旦泛素被重組，LexA-VP16就被釋放到核中并激活報告基因的轉錄（如HIS3，LacZ）。

這種轉錄激活方式放大了蛋白的互作反應，對瞬時互作的檢更敏感、更方便。此系統已被成功用于檢測不同種類膜蛋白間的互作反應。分裂泛素系統已被廣泛應用于cDNA文庫篩選和大規模矩陣法中。

近期，改進后適用于胞質蛋白互作篩選的MbY2H系統已被發布。在此改進方案中，誘餌載體上包括Cub和轉錄因子，并且由于融合了ER膜蛋白Ost4p，使此融合蛋白錨定在ER膜上。

發展前景

在后基因組時代更具意義且更能發揮酵母雙雜交技術的領域是研究生命活動中的網絡調節。第一個具有開拓性的工作是Bartel利用酵母雙雜交技術建立了一個T7-噬菌體的網絡調節圖（linkage-map）。

Fromont-Racine等對篩選到的陽性克隆進行鑒定測序，并將它們分為5類，然后對其中的四類（非編碼序列除外）通過15輪的篩選與分析，繪制出一張綜合了酵母蛋白相互作用的全局性信息圖。這是以往的實驗所難以獲得的。

為適應功能基因網絡調控研究的需要，CLONTECH公司在Merck-Washington大學的EST項目研究成果基礎上，采用了與傳統建庫方式完全不同的細胞內同源重組方法，以高通量規模構建了一種陣列模式的酵母雙雜交cDNA文庫。它主要有以下特點：

（1）來源于多種組織器官和細胞系，因此含有幾乎所有基因的cDNA；

（2）所含各種cDNA的豐度趨于平衡；

（3）含有較長的插入序列，但不是全長cDNA序列。

這樣既避免了5’非編碼區可能存在的終止密碼阻礙融合蛋白的翻譯，又保證了表達出的蛋白構象接近于天然。這種建庫方法不僅減少了工作量，而且在雙雜交中新發現的相互作用蛋白種類也明顯增多。

最后，有必要指出的是，酵母雙雜交技術必須與其它技術結合才能有利于對實驗結果作出更為完整和準確的判斷。

參考資料