定量分析法

定量分析方法的方法學驗證

定量分析方法的方法學驗證

定量分析方法驗證的目的是證明采用的含量測定方法適合于相應分析要求，在進行定量分析方法學研究或起草藥品

質量標準時，分析方法需經驗證。

驗證內容有：線性、范圍、準確度、精密度（包括重復性和重現性）、檢測限、定量限和耐用性等。

一，線性

線性是指在設計的范圍內，測試結果與試樣中被測物質濃度直接呈正比關系的程度。

應在規定的范圍內測定線性關系。可用一貯備液經精密稀釋，制備一系列供試品的方法進行測定，至少制備五

份供試樣品；以測得的響應信號對被測物濃度作圖，觀察是否呈線性，再用最小二乘法進行線性回歸。必要時，響

應信號可經數學轉換，再進行線性回歸計算。回歸方程的相關系數(r)越接近于1，表明線性關系越好。

用UV法測定時，以對照品配制一定濃度范圍的對照品系列溶液，吸光度A一般在0.3～0.7，濃度點n＝

5，用濃度C對A作線性回歸，得一直線方程，方程的截距應接近于零，相關系數r應大于0.9999。

用HPLC法測定時，以對照品配制一定濃度范圍的對照品系列溶液，濃度點n＝5～7，用濃度C對

峰高h或峰面積A或被測物與內標物的響應值之比進行線性回歸或非線性擬合（如HPLC-ELSD），建立方程，

方程的截距應趨于零，相關系數r應大于0.999。

線性關系的數據包括相關系數、回歸方程和線性圖。

二，范圍

范圍系指能達到一定精密度、準確度和線性，測試方法適用的高低限濃度或量的區間。

范圍應根據分析方法的具體應用和線性、準確度、精密度結果及要求確定。對于有毒的、具特殊功效或藥理作

用的成分，其范圍應大于被限定含量的區間。

三，精確度

準確度系指用該方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度，一般用回收率(％)表示。準確度應在規定的

范圍內測試。用于定量測定的分析方法均需做準確度驗證。

1.測定方法的準確度

可用已知純度的對照品做加樣回收率測定，即于已知被測成分含量的供試品中再精密加入一定量的已知純度的

被測成分對照品，依法測定。用實測值與供試品中含有量之差，除以加入對照品量計算回收率。

在加樣回率收試驗中須注意對照品的加入量與供試品中被測成分含有量之和必須在標準曲線線性范圍之內；加入的

對照品的量要適當，過小則引起較大的相對誤差，過大則干擾成分相對減少，真實性差。

回收率%=[(C-A)/B]*100%

式中，A為供試品所含被測成分量；B為加入對照品量；C為實測值。

2.數據要求

在規定范圍內，取同一濃度的供試品，用6個測定結果進行評價；或設計3個不同濃度，每個濃度各分別制

備3份供試品溶液進行測定，用9個測定結果進行評價，一般中間濃度加入量與所取供試品含量之比控制在l∶1

左右，其他兩個濃度分別約為供試品含量的80%和120%。應報告供試品取樣量、供試品中含有量、對照品加入

量、測定結果和回收率(％)計算值，以及回收率(％)的相對標準偏差(RSD)或可信限。

四，精密度

精密度是指在規定的測試條件下，同一個均勻供試品，經多次取樣測定所得結果之間接近的程度。

1.精密度的表示方法

氣相色譜法和高效液相色譜法是對同一供試液進行至少五次以上的測定；精密度一般用相對標準偏差(relative

standarddeviation,RSD)表示：RSD=標準偏差/平均值′100％

精密度報告的數據應包括平均值、可信限及相對標準偏差。

一般在一天之內進行的精密度考察稱為日內精密度(inter-dayvariability)；在三天之內進行的精密度考察稱為

日間精密度(intra-dayvariability)。

有時為了考察隨機變動因素對精密度的影響，還需設計進行中間精密度試驗，變動因素包括不同日期、不同分

析人員和不同設備。

2.重復性（repeatability）

是指在同一條件下對同一批樣品，從樣品供試品液制備開始，制備至少六份以上供試品溶液(即n>6),或設計

3個不同濃度，每個濃度各分別制備3份供試溶液，進行測定，計算其含量的平均值和相對標準偏差(RSD)。RSD

一般應根據樣品含量高低、含量測定方法和繁簡進行制訂，如含量很低一般不大于5％；如含量較高，則應從嚴要

求。

3.重現性（reproducibility）

是指在不同的實驗室由不同分析人員測定結果的精密度。當分析方法將被法定標準采用時，應進行重現性試驗。

如建立藥典分析方法時，通過協同檢驗得出重現性結果，協同檢驗及重現性結果均應記載在起草說明中。應注意重

現性試驗樣品本身的質量均勻性和儲存運輸中的環境影響因素，以免影響重現性結果。

五，檢測限

檢測限是指試樣中被測物質能被檢測出的最低濃度或量。檢測限是一種限度檢驗效能指標，即反映方法與儀器

的靈敏度和噪音的大小，也表明樣品經處理后空白(本底)值的高低。它無需定量測定，只要指出高于或低于該規

定的濃度或量即可。根據所采用的分析方法來確定檢測限。

當用GC和HPLC法時，可用已知低濃度樣品測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，計算出能被可靠

地檢測出的最低濃度或量。一般以S/N＝2或S/N＝3時的相應濃度或注入儀器的量確定檢測限。

檢測限的報告數據應附圖譜，說明測試過程和檢測限結果。

六，定量限

定量限是指樣品中被測物質能被定量測定的最低量，其測定結果應具有一定準確度和精密度。常用信噪比法測

定定量限。一般以S/N＝10時相應的濃度或注入儀器的量進行確定。

七，耐用性

耐用性系指在測定條件有小的變動時，測定結果不受影響的承受程度，為使方法用于常規檢驗提供依據。開始

研究分析方法時，就應考慮其耐用性。如果測試條件要求苛刻，則應在方法中寫明。典型的變動因素有：被測溶液

的穩定性，樣品提取次數、時間等。液相色譜法中典型的變動因素有：流動相的組成比例或pH值，不同廠牌或不

同批號的同類型色譜柱，柱溫，流速及檢測波長等。氣相色譜法變動因素有：不同廠牌或批號的色譜柱、固定相，

不同類型的擔體，柱溫，進樣口和檢測器溫度等。薄層色譜的變動因素有：不同廠牌的薄層板，點樣方式及薄層展

開時溫度及相對濕度的變化等。

經試驗，應說明小的變動能否通過設計的系統適用性試驗，以確保方法有效。