核蛋白

核蛋白提取

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實驗準備：

14℃離心機

2根據標本數計算所需I，II，III，IV總體積，取出液體，并加入蛋

白酶抑制劑，（III由加蛋白酶抑制劑I與加蛋白酶抑制劑II混合物）

實驗操作：

1收集細胞。10ml對照細胞（1-2*105/ml）培養48h后，15ml離心

管收集，300g（1370rpm）*5min。棄上清，加1ml1*PBS輕輕渦

旋混勻后轉移至1.5mlEP管。

24℃，300g*5min，棄上清。

3重懸細胞于120μl緩沖液I。

4重懸細胞于120μl緩沖液II，4℃輕微旋轉混勻，15min。

54℃2500rpm*1min。

6轉移上清（胞漿蛋白）至新管。

7在沉淀中緩慢加120μl緩沖液III，輕微顛倒混勻，離心：4℃，2500

rpm*1min。

8棄上清，加130μl緩沖液IV（+蛋白酶抑制劑），4℃旋轉混勻1h。

9離心4℃，13000g*10min。

10轉移上清（核蛋白）至一新管，定量。

核提取緩沖液I（15ml）

25mMHEPES375μlHEPES

5mMKCl75μl1MKCl

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0.5mMMgCl27.5μl1MMgCl2

DDH2O14.54ml

核提取緩沖液II（15ml）

25mMHEPES375μlHEPES

5mMKCl75μl1MKCl

0.5mMMgCl27.5μl1MMgCl2

1%NP-40150μlNP-40

DDH2O14.39ml

核提取緩沖液III（15ml）

25mMHEPES250μlHEPES

10%Sucro1gSucro

350mMNaCl700μl5MNaCl

0.01%NP401μlNP-40

DDH2O9.1ml

5MNaCl：14.61g/50mlH2O

注：

1在提取漿蛋白后，吸去上清時，如第一次用100μl槍洗不干凈，再

離心，然后用10μl槍吸盡液體。再用III液洗一遍，如前步驟吸盡液

體，再加IV液，這樣的去除漿蛋白污染效果較好些。

2胞漿蛋白混胞核蛋白原因：因為藥物高濃度時，胞核會破裂，所以

會在高濃度處理組中胞漿蛋白混有胞核蛋白較嚴重；

3胞核蛋白對照組有時會提不到原因：可能是因為沒有藥物處理，所

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以其核不容易破開。如需要，可在步驟8去掉胞漿蛋白后用槍頭打勻，

并振蕩（我還沒試過，這里只是建議）。

4我們漿蛋白內參用GAPDH或actin，沒差別。核蛋白用HistoneH3。

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