黃酮提取工藝設計思路
1、黃酮類化合物含量測定的原理
在中性或弱堿性及亞硝酸鈉存在條件下，黃酮類化合物與鋁鹽生成螯合物，加入氫氧化鈉溶液后顯紅橙色。黃酮類化合物能與金屬離子絡合產生有色反應，于波長510nm附近有吸收，可用分光光度法進行測定。實驗采用在堿性條件下，亞硝酸鹽存在時，硝酸鋁與黃酮形成紅色絡合物，在波長510nm附近有吸收可進行比色分析。
在中性或弱堿性及硝酸鈉存在條件下，黃酮類化合物與鋁鹽生成鰲合物，加入氫氧化鈉溶液后顯紅橙色，硝酸鈉還原黃酮，加硝酸鋁絡合，加氫氧化鈉使黃酮類化合物開環，生成2'-OH查耳酮而顯色。
利用黃酮類化合物中的3－羥基、4－羥基、5－羥基、4－羰基或鄰二位酚羥基，與Al3＋進行絡合反應，在堿性條件下生成紅色絡合物的原理測定其含量
、測定波長的確定2取樣品溶液和標準溶液2mL，加70 %的乙醇至5 mL, 然后加入5 %的NaNO2 溶液1 mL,
室溫放置6min, 再加入10 %的Al(NO3)3 1mL, 混勻, 室溫放置6 min, 加入4%的NaOH
10mL, 用水稀釋至25 mL，混勻, 放置15 min, 在分光光度計上掃描波長從400 nm～600 nm
之間的吸收度, 結果在510nm 波長處有最大吸收值。
配合物在Kmax= 354nm 及Kmax= 510nm有兩個吸收峰, 經實驗后得出Kmax= 112354nm波長處得到的工作曲線線性關系及精密度數據均不佳, 故本實驗選取Kmax= 510 2nm為測定波長。
3、標準溶液的配制精確稱取105℃干燥恒重蘆丁對照品50mg, 加乙醇適量, 使之充分溶解, 用乙醇定容到100mL, 搖勻, 制得蘆丁溶液。精確量取蘆丁溶液20mL, 置于50mL容量瓶中, 用水稀釋至刻度, 搖勻, 即得對照品溶液。每1mL溶液含蘆丁對照品0.2mg。或精密稱取干燥至恒重的蘆丁標準品10mg, 置50mL容量瓶中, 加無水乙醇20mL, 輕搖使充分溶解，定容, 搖勻, 得0. 2mg /mL蘆丁標準液。
精確稱取蘆丁標準品5mg，用70%乙醇溶解，于50 mL容量瓶中定容，即得每1mL溶液含蘆丁對照品0.1mg蘆丁標準品溶液。
干燥器中冷卻，精確稱,℃烘箱下烘干至恒重105蘆丁標準品于稱量瓶中置20mg稱取約．
取10 mg蘆丁標準品，用70%乙醇定容至100 ml為標準液。
、樣品溶液的測定方法4 4.1、標準曲線的繪制精確量取對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL, 分別置于25mL容量瓶中。分別加水至6mL, 加5%亞硝酸鈉溶液1.0mL, 混勻, 放置6min; 加10%硝酸鋁溶液1.0mL,
搖勻, 放置6min; 加1% 氫氧化鈉溶液10.0mL, 再加水至刻度, 搖勻, 放置15min。用分光光度法在510nm波長處分別測定其吸光度。以吸光度為縱坐標, 濃度為橫坐標, 用最小二乘法對直線進行回歸計算，令回歸方程為：y=ax+b，繪制標準曲線, 得回歸線方程: Y = 11. 321 43X + 0. 00343( r= 0.9998), 在8~40μg/mL的范圍內，濃度與吸收度有良好的線性關系。
分別取0. 0、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0 mL的0. 1mg/mL蘆丁標準溶液于6支比色管中，分別加入0. 3 mL 5%亞硝酸鈉，放置6 min，加0. 3 mL 10%硝酸鋁后放置6 min,，再加1. 0mol/L NaOH 4.0mL，加70%乙醇定容至10 mL，搖勻，放置12min得測定液。以空白溶液作參比，在λ= 510nm處測吸光度，計算標準液濃度(C)與吸光度(D)的回歸方程D = bC + k。
精確吸取蘆丁標準液0、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0 ml分別置于6支具塞試管中，各補70%乙醇至5. 0ml，加5%亞硝酸鈉溶液0. 3 ml,，搖勻，放置6 min后，加10%硝酸鋁溶液0. 3ml，搖勻，放置6 min后，再加4%氫氧化鈉溶液4. 0ml，加水0. 4ml，搖勻，放置15 min后，在510 nm
處測吸光度-濃度值，所得吸光度-濃度曲線見圖，回歸方程如下: A =12. 721 0C - 0.
，相關系數r = 0. 999802903。
、樣品處理4.2取采回的新鮮蘆蒿葉，洗凈，參考相關文獻，在105℃烘至約八成干，剪成約1 cm 長度，
用粉碎機粉碎，再在105℃烘至恒重。采用Soxhlet提取法，以無水乙醚為脫脂劑，于43℃水浴中脫脂至充分除去樣品中脂類和脂溶性色素。取出樣品濾紙包，先置通風處晾干，再將濾紙包置烘箱中130 ℃烘干，放入干燥器中冷卻備用。
4.3、樣品處理方法濕熱法：將鮮葉置于高壓反應釜加壓蒸30min，另取鮮葉常壓蒸30min。將陰干葉置于高壓反應釜加壓蒸15min，另取陰干葉常壓蒸15min。
氧化法：（1）H2O2法：將鮮葉、陰干葉分別用用2倍量H2O2浸泡10min（H2O2濃度℃）、50、2%（30min℃）、30、0.5%（30min℃）、40、2%（10min℃）、50、溫度1%．
60min（0.5%、40℃）、60min（1%、30℃）。（2）KMnO4法：將鮮葉、陰干葉分別用用2倍量KMnO4浸泡10min（KMnO4濃度1%、溫度50℃）、10min（2%、40℃）、30min（0.5%、30℃）、30min（2%、50℃）、60min（0.5%、40℃）、60min（1%、30℃）。
4.3、樣品溶液的測定4.3.1、分光光度法
精確量取樣品溶液5. 0 mL, 置于25 mL容量瓶中, 按照2.1中方法進行操作, 在510nm
波長處測定吸光度A1; 再精確量取樣品溶液5.0mL, 置于25mL容量瓶中, 加水至刻度, 搖勻, 在510nm 波長處測定吸光度A2。取2次吸光度的差值, 由回歸線方程計算樣品中黃酮類化合物的提取率。
HPLC 法4.3.2、取上述樣品總黃酮提取液濃縮物，用甲醇溶解，進樣前用0.45 μm 濾膜過濾。高效液相色譜儀：LC- 9A(日本SHMADZU) ；色譜柱：Dima Technologies(C18 迪馬公司)，規格：250 mm×4.6 mm；柱溫為室溫；流速1 mL/min；檢測器：SPD-10A；檢測波長254 nm；進樣量20 μL；流動相：80%甲醇。在進柱之前，流動相要經過0.45μm 的有機膜過濾，并超聲脫氣30 min。
、溶劑選擇5分別稱取樣品1g，以提取溫度90℃，提取時間2 h ，分別利用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚為溶劑，料液比1:50(g/mL)為提取條件進行常壓回流提取，以此結果進行比較。
6、線性范圍、回歸方程和檢出限
總黃酮的線性范圍在1.0～40μg/ml 之間，所得回歸方程為y=0.0033x－0.0109，相關系數為0.9995，檢出限為1.0μg/ml。
、顯色劑穩定性實驗7精確量取標準溶液和樣品提取液1.0mL, 同標準曲線和樣品測定的操作，分別于配制后每隔5min測定其吸光度考察反應體系的穩定性。結果顯示其RSD值為0. 5097% , 說明樣品溶液在1h內穩定。
8、加標回收率實驗取已測得黃酮類化合物提取率的樣品溶液2.0mL, 加入0.2mg/mL的蘆丁對照液1. 0mL,
該方法對, 。表明2. 135%值為99. 12%, RSD 計算回收率。加樣回收率為, 按實驗方法測定
黃花菜中黃酮類化合物提取率測量的準確度較高。回收率= (混合后測得的總黃酮含量-樣品中總黃酮含量)/蘆丁標準品加入量×100%。
分別取0.2g含總黃酮的樣品于兩支15ml具塞比色管中，各加入4ml乙醇，其中1管加入0.100mg 蘆丁標準品作為加標測定管，另1管作為本底管，再按最佳試驗條件進行樣品處理，用標準曲線法進行計算，重復試驗3次，計算回收率。由表8可知，該方法的回收率為95%~104%，證明該方法的準確度較好。
取5個10mL比色管，在已知黃酮含量的蓖麻葉和蓖麻花提取液中分別加入0.2mg/mL蘆丁對照品溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL樣液，分別測定黃酮含量，根據所得的總黃酮含量減去加入的標量，再除以樣品所含的總黃酮量即可計算出回收率。
回收率%= 樣品加標準樣測得總黃酮含量?樣品中總黃酮含量/加入標準液總蘆丁的含量×100%
回收率/%
平均回收率/% 樣品測定值序號加標量/mg 加標后測定RSD/%
值）mg /ml
（mg/ml0.2000 1
2 0.2000
3 0.2000
4 0.2000
0.2000
5
9、精密度實驗
取5份同一樣品溶液各5.0mL, 置于25mL容量瓶中, 按實驗方法測定，計算其平均含量和相對標準偏差。其RSD 值平均為0.162%, 測定結果的相對標準偏差很小, 說明儀器的精密度較高, 實驗數據可靠。
在正交試驗得出的最佳條件下，樣品用超聲波提取后測定總黃酮提取量，重復試驗5
次，計算保健食品總黃酮提取量為（5.370±0.092）mg，RSD 為1.717%，證明該方法的精密度較好。
按微波提取法同時制備5份試樣液，按標準曲線方法對試樣液中總黃酮含量進行平行測定。
精密稱取車前草供試品3份，每份測試3次，結果見表2，相對標準偏差為3. 20 %(m =3)。精密移取蘆丁標準液1mL，共5 份，分別置于10mL試管中，按1.3.3.2 節操作，計算吸光度的相對標準偏差(RSD)。
10、重現性試驗。取同一批大白口蘑樣品6份，在最佳條件下進行萃取，分別測定各自的總黃酮含量，結果表明，其相對標準偏差為1.24%。
在同一實驗室、不同時間對樣品葉中總黃酮含量進行5次重復測定。
11、金屬離子的干擾實驗
銀杏葉提取物作為生物活性物質, 許多金屬離子對它的測定都有一定影響。本實驗選取常見的Zn2+ 、Fe3+ 進行實驗。實驗表明Zn2+ 對反應無影響, 加入1 mL 100Lg?m L Fe3+
溶液, 掃描發現在波長510 nm 無吸收峰, 由此可知Fe3+ 對實驗測定影響很大。本實驗選擇EDTA做掩蔽劑。
12、黃酮類化合物的定性檢測12.1、三氯化鋁反應
取8支試管，分別加入少許經上述各提取方法所得的樣品，用95%乙醇完全溶解，每只試管中再加1%三氯化鋁乙醇溶液1～2 mL，觀察顏色變化情況。在三氯化鋁反應中，原來的黃色加深，并有黃色或黃綠色熒光，原因是與鋁離子產生了螯合物而呈現出鮮黃色。濾紙上無明顯顏色變化，紫外燈下顯鮮黃色熒光，可能不含4'-羥基黃酮醇和7，4'-二羥基黃酮醇等黃酮類化合物。黃色或黃綠色：有黃酮類化合物。
、鹽酸-鎂粉還原反應12.2將經上述各提取方法所得的樣品分別溶于盛有95%乙醇的試管中，待完全溶解后加少許鎂粉，再加數滴濃鹽酸，觀察顏色變化情況。在鹽酸-鎂粉還原反應中，溶液呈現出橙黃色或紫紅色，這是由于黃酮類化合物被還原生成花色苷元及其二聚物。試液呈現紅色，可能含黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇等黃酮類化合物。
取樣品液5mL，加入少許鎂粉振搖，滴加數滴濃鹽酸，微熱2min。并作空白對照實驗（在樣品液中僅加入濃鹽酸進行觀察）。可觀察到在用粗提取液進行預試時，加入濃鹽酸后升起的泡沫顏色呈紫紅色，溶液顯橙紅色，表明樣品液中有黃酮類物質存在。橙紅色：黃酮類化合物。
取自制的黃酮樣品少許置于試管中，加5%vol的乙醇2mL，在水浴中加熱溶解，滴加2，即產生劇烈的反應。反應過程中溶液顏色逐漸由黃色變為橙50mg，再加鎂粉約HC1滴濃．
紅色。此現象表明被測物為黃酮類物質。
、四氫硼鈉反應12.3取8支試管，分別加入少許經上述各種方法提取所得到的樣品，用95%乙醇完全溶解后加數滴四氫硼鈉，觀察顏色變化情況。在四氫硼鈉反應中，溶液由淺黃色變為紅色或紫紅色，此反應是二氫黃酮類化合物的專屬反應。
、與堿反應12.4試液變黃色，可能含二氫黃酮、黃酮醇等黃酮類化合物。棕黃色，空氣氧化變褐色：有黃酮醇類或查耳酮。4%氫氧化鈉反應，棕色，有黃酮類化合物。
、鋁鹽反應12.5取樣品提取液5 mL，加入0.3mL 5% NaNO2，充分混勻，混勻后靜置5min，加入0.3mL
10% Al(NO3)3，混勻后靜置6min，加入2mL1 mol/L NaOH，混勻，靜止10min。可觀察到有磚紅色的顏色產生，表明提取液中有黃酮類物質。黃色：有黃酮類化合物。
12.6、濃氨水反應
提取物乙醇溶液點在濾紙上，置于濃氨水上方30 s, 紫外燈下觀察, 顯黃色熒光斑點。棕黃色，有黃酮類化合物。
三氯化鐵反應12.7、1%藍色：黃酮類化合物。12.8、1%醋酸鉛反應
黃色沉淀：黃酮類化合物。12.9、濃硫酸反應
橙色：黃酮類化合物。12.10、熔點測定
取提取的蓮子心黃酮樣品，經多次重結晶提純，測其熔點230℃~230.5℃。
12.11、紅外光譜圖的比較
取精制的黃酮樣品和黃酮（蘆丁）對照品，溴化鉀壓片法繪制紅外光譜圖。測試條件：掃描范圍4000cm-1~400cm-1；分辨率4cm-1，掃描次數32
、總黃酮提取量即得率和提取率計算13 、總黃酮提取量即得率計算13.1．
Y＝C×V1×（V2/V3）/m
式中，Y 為黃酮含量（mg/g），C為測定液黃酮濃度（mg/mL），V1為測量時定容
的體積（mL），V2為提取液體積（mL），V3為測量時取液體積（mL），m 為提取時原料質量（g）。總黃酮得率X（%）＝n×C×V/m×100%
式中：n為提取液稀釋倍數；C為提取液中總黃酮濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；m為果渣的重量，mg；X總黃酮得率。
100V1 ×103 ×P =C ×V ×n/W ×式中:P—總黃酮類物質含量, g/100 g;C—從回歸方程計算得樣品中黃酮類物質質量,
mg;n—稀釋倍數;V —濃縮液的體積, mL;V1 —測定體積, mL;W—投料量, g。
13.2、總黃酮提取率計算
提取率= [提取的總黃酮質量/原料質量×原料中總黃酮含量] ×100%
14、單因素試驗
14.1、乙醇體積分數的影響取樣品1g 左右，分別加入0%、10%、20%、30%、40%、50`%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液，在100℃條件下快速萃取法提取5min，測定提取液黃酮含量，并計算得率。
14.2、不同提取溫度取樣品1g，乙醇體積分數60%，分別20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃于用快速萃取法提取5min，測定提取液黃酮含量，并計算得率。
14.3、不同提取時間
取樣品1g，乙醇體積分數60%，在100℃分別快速萃取30min、60min、90min、120min、150min、180min，測定提取液黃酮含量，并計算得率。
、不同粒度14.4取樣品1g，乙醇體積分數60%，分別于20目、40目、60目、80目、100目、
120目用快，測定提取液黃酮含量，并計算得率。5min速萃取法提取．
14.5、提取次數
取樣品1g，乙醇體積分數60%，在100℃快速萃取1 0mi n ，分別萃取1 、2 、3 、4 、5次，測定提取液黃酮含量，并計算得率。
14.6、料液比取樣品1g，乙醇體積分數60%，分別于1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80用快速萃取法提取5min，測定提取液黃酮含量，并計算得率。
15、超聲波提取總黃酮15.1、乙醇溶液濃度對總黃酮提取的影響15.2、超聲溫度對總黃酮提取的影響
、超聲時間對總黃酮提取的影響15.3 15.4、料液比對總黃酮提取的影響15.5、提取次數對總黃酮提取的影響15.6、目數對總黃酮提取的影響
超聲時間的選擇、間隙/ 15.7 15.8、浸泡時間選擇16、微波提取總黃酮16.1 、乙醇濃度對黃酮提取率的影響16.2、液固比對黃酮提取率的影響
16.3、微波功率對黃酮提取率的影響16.4、微波輔助提取時間對黃酮提取率的影響
16.5、0103%的非離子表面活性劑B對黃酮提取率的影響（椰油酰胺甜菜堿(CAB)，十二烷基硫酸鈉( K12 ) ，十六烷基三甲氯(溴)化銨(1631)，椰油酰基二乙醇胺(6501)，三乙醇胺，椰子油醇醚羧酸鈉(CES)，椰油酰胺丙基甜菜(CAB - 35)，十二烷基苯磺酸鈉(LAS)，十二烷基硫酸銨(K12A) 、吐溫80( Tween 80)、十二烷基三甲基氯化銨( DTAC)）
16.6、提取次數對總黃酮提取量的影響
、超高壓提取總黃酮17 17.1、乙醇濃度17.2、壓力、料液比17.3
17.4、處理時間
、提取次數17.5 18、驗證試驗根據篩選得到的最佳提取條件A3B2C3D2，平行提取3次，計算總黃酮的提取率。結果見表4。經實驗驗證，根據最佳的提取條件所得的總黃酮的提取率均大于正交設計中總黃酮的提取率，因此本最佳工藝條件合理，同時也表明此工藝具有較好的穩定性。
19、粗總黃酮的純化
、樹脂預處理19.1用40目篩在水中篩選出大小合適、分布均勻的樹脂，將新的D101/AB-8大孔吸附樹脂用2
倍體積的95%乙醇浸泡24h, 并不時攪動, 使樹脂充分溶脹。將樹脂置于玻璃色譜柱( 30mm×500mm) 中, 用95%乙醇淋洗, 檢測流出液, 直至淋洗后流出液與水混合( 1︰5)
后不再出現白色混濁, 用大量重蒸餾水洗去乙醇至無醇味，用4倍體積5%的HCl溶液浸泡3-4h，用去離子水洗至中性，再加入大約4倍體積的5%的NaOH溶液浸泡3-4h，再用純化水洗至中性，備用。
19.2、樹脂的吸附和解吸:
將已預處理的D101 大孔吸附樹脂裝入柱中, 將按最佳工藝提取的黃酮粗提液回收乙醇, 調至濃度為0.5 mg / mL上柱, 以0.5 mL/min流速吸附后用3倍柱床體積純化水洗至流出液無色, 再用4倍量70%的乙醇解吸, 得解吸液。
19.3、產品的處理解吸液真空干燥至恒重, 稱定質量。按方法測定吸光度, 根據回歸方程計算解吸液中總黃酮含量。按下式計算黃酮的純度: 黃酮的純度(%) = W/ W0×100%。式中, W 為解吸液中黃酮的含量( g) ,W0為解吸液干燥后的質量( g) 。
大孔吸附樹脂對臘梅花總黃酮的吸附率的測定：稱取預處理好的樹脂2.0g于具塞磨口三角瓶中，準確
加入臘梅花黃酮類水溶液30ml, 在室溫下置于振蕩器上振蕩24h，充分吸附后，測定濾液中剩余黃酮的濃度，按照下式計算吸附率：
吸附率(%) = ( C1- C2 ) / C1×100式中, C1為吸附前濃度(mg/L) ; C2為吸附后剩余液的濃度(mg/L)。
大孔吸附樹脂對臘梅花總黃酮的脫附率的測定：取上述得到的飽和樹脂, 準確加入50
