中國組織工程研究 第19卷 第8期 2015–02–19出版
Chine Journal of Tissue Engineering Rearch February 19, 2015 Vol.19, No.8
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 1149
www.
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年爭好，男，1988年生，安徽省宿州市人，漢族，天津醫科大學在讀碩士，醫師，主要從事骨與關節修復研究。
通訊作者：李暉，主任醫師，碩士生導師，天津醫科大學總醫院骨科，天津市 300052
通訊作者：李瑞欣，副研究員，解放軍軍事醫學科學院衛生裝備研究所， 天津市 300161
doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2015.08.001 []
中圖分類號:R318 文獻標識碼:A 文章編號:2095-4344 (2015)08-01149-06 稿件接受：2015-01-08
Nian Zheng-hao, Studying for master’s degree, Physician, General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China; Institute of Medical Equipment, Academy of Military Medical Science, Tianjin 300161, China; Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China
Corresponding author: Li Hui, Chief physician, Master’s supervisor, General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China
Corresponding author: Li Rui-xin, Associate rearcher, Institute of Medical Equipment, Academy of Military Medical Science, Tianjin 300161, China
Accepted: 2015-01-08
納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白復合骨組織工程支架材料的生物相容性
年爭好1
，2，3
，李 暉1，李瑞欣2，孫 凱1
，2，3
，李 東1
，2，3
，徐 成2，張西正2(1天津醫科大學總醫院，天津市 300052；2解放軍軍事
醫學科學院衛生裝備研究所，天津市 300161；3天津醫科大學，天津市 300070)
文章亮點：
1 大量的研究表明絲素蛋白、膠原蛋白和羥基磷灰石，無毒無味，具有良好的生物學特性和理化性質。但單獨使用時都暴露一些不足，如絲素降解較慢、干燥時易碎裂；膠原降解速度過快，機械強度較低；簡單合成的羥基磷灰石材料成型后強度低、孔隙度小。而通過將兩種及兩種以上材料共混制備復合支架材料可以彌補各自的不足，利用各種材料的互補特性來滿足組織工程對支架的要求，受到越來越多的關注。
2 實驗將納米羥基磷灰石、膠原蛋白與絲素蛋白的質量比分別設為1∶1∶5、1∶2∶5、1∶3∶5，采用冷凍干燥法制備復合支架，發現質量比為1∶2∶5時，復合支架的孔隙率、孔徑及壓縮彈性等相應參數性能符合組織工程骨組織構建要求，并且具有良好的細胞相容性。 關鍵詞：
生物材料；骨生物材料；絲素蛋白；膠原蛋白；納米羥基磷灰石；骨組織工程；支架材料；細胞相容性；國家自然科學基金
主題詞：
膠原；絲素蛋白；羥基磷灰石類；組織工程
基金資助：
國家自然科學基金資助項目(11432016，31370942，11072266)
摘要
背景：通過將兩種及兩種以上材料共混制備復合支架材料可以彌補各自的不足，利用各種材料的互補特性來滿足組織工程對支架的要求。
目的：制備納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白復合三維支架材料，并研究其細胞相容性。
方法：將納米羥基磷灰石、膠原蛋白與絲素蛋白分別按質量比為1∶1∶5、1∶2∶5、1∶3∶5的比例混合，制備納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白復合材料，測試其孔隙率、孔徑大小、吸水膨脹率及壓縮
力學性能。將表征結果良好的質量比為1∶2∶5的納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白復合材料與MC3T3-E1細胞體外復合培養，MTT 法檢測復合培養2，4，6，8，12 d 后的細胞活性。
結果與結論：羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白按質量1∶2∶5的比例混合更符合要求：孔徑98-260 μm ，孔隙率為(96.72±2.78)%，吸水膨脹率為(549.37±35.29)%，生物力學試驗機測定其力學性能穩定、壓縮應變及彈性模量等指標適宜骨組織工程研究應用。MC3T3-E1細胞在納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白復合三維支架上生長增殖良好，表明納米羥基磷灰石/膠原/絲素復合三維支架具有良好的細胞相容性。
年爭好，李暉，李瑞欣，孫凱，李東，徐成，張西正. 納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白復合骨組織工程支架材料的生物相容性[J].中國組織工程研究，2015，19(8):1149-1154.
Biocompatibility of nano-hydroxyapatite/collagen/silk fibroin composite scaffolds for bone tissue engineering
Nian Zheng-hao 1, 2, 3, Li Hui 1, Li Rui-xin 2, Sun Kai 1, 2, 3, Li Dong 1, 2, 3, Xu Cheng 2, Zhang Xi-zheng 2 (1General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China; 2Institute of Medical Equipment, Academy of Military Medical Science, Tianjin 300161, China; 3Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China)
Abstract
BACKGROUND: Composite scaffolds made of two or more materials can meet the requirements of tissue engineering scaffolds bad on the complementary properties of various materials.
OBJECTIVE: To prepare three-dimensional nano-hydroxyapatite (nHA)/collagen (COL)/silk fibroin (SF) scaffolds and to study their biocompatibility.
METHODS: Composite scaffolds were prepared by mixing nHA, COL and SF at different ratios of 1:1:5, 1:2:5, 1:3:5. In order to find out the best mixing ratio of SF, COL and nHA, the porosity, pore size, water absorption and mechanical properties were determined. MC3T3-E1 cells were cultured in the nHA/COL/SF scaffolds composite scaffold (1:2:5) in vitro to obrve the biocompatibility. Cell viability was detected after co-culture for 2, 4, 6, 8, 12 days using MTT.
RESULTS AND CONCLUSION: It was more suitable for bone scaffolds when the mixed ratio of nHA, COL and SF was 1:2:5. The pore size was 98-260 μm, the porosity was (96.72±2.78)%, and the water absorption was (549.37±35.29)%. The stability of its mechanical properties, compressive strain and elastic modulus and other
indicators were measured by biomechanical testing machine, which are suitable for bone tissue engineering applications. MC3T3-E1 cells grew well in the nHA/COL/SF composite scaffold, indicating the composite scaffold has good cytocompatibility.
Subject headings: Collagen; Silk; Hydroxyapatites; Tissue Engineering
Funding: the National Natural Science Foundation of China, No. 11432016, 31370942, 11072266
Nian ZH, Li H, Li RX, Sun K, Li D, Xu C, Zhang XZ. Biocompatibility of nano-hydroxyapatite/collagen/silk fibroin composite scaffolds for bone tissue engineering. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2015;19(8):1149-1154.
0 引言 Introduction
骨組織工程的出現為骨缺損修復帶來了新的思路和方法。骨組織工程研究至今已取得很大進展，但仍存在許多問題亟待解決。支架材料作為骨組織工程的關鍵因素，目前仍舊沒有可以作為“金標準”的支架，因此找到一種更加適合作為骨組織支架的材料是骨組織工程研究中急需解決的難點之一。
大量的研究表明絲素蛋白、膠原蛋白和羥基磷灰石，無毒無味，具有良好的生物學特性和理化性質[1-5]。羥基磷灰石是天然骨無機鹽的主要成分，具有良好的骨傳導性與生物相容性[6-7]，被認為是骨缺
損修復的理想材料，尤其是納米級羥基磷灰石與天然骨中的無機成分相似，引入到復合材料中可使材料在力學和生物學方面具有很大的優越性和應用潛力。但羥基磷灰石也有其自身的缺點，如生物力學強度不理想、骨誘導活性低等[8-9]。
膠原是天然骨的主要有機成分，具有良好的生物相容性、生物降解性、剛性和抗張能力。當前，國內外相關骨組織工程材料研究中，選用的膠原蛋白大多為Ⅰ型膠原蛋白，這是因為天然骨組織中Ⅰ型膠原蛋白是含量最多的有機基質[10]。絲素蛋白是從蠶絲中提取的天然生物材料，無毒、無刺激、價廉、易獲取，在生物醫學有廣泛的用途[11-14]，其具有機械強度高、生物相容性良好、生物降解性慢、制備方法多樣易得等特點，支持多種細胞黏附、分化和生長，可應用于人工韌帶、軟骨、骨、神經組織等方面[15-16]。但單獨使用時都暴露一些不足，如絲素降解較慢、干燥時易碎裂[17]；膠原降解速度過快，機械強度較低[18-19]；簡單合成的羥基磷灰石材料成型后強度低、孔隙度小[10，20]。而通過將兩種及兩種以上材料共混制備復合支架材料可以彌補各自的不足，利用各種材料的互補特性來滿足組織工程對支架的要求，受到越來越多的關注[21-22]。
鑒于此，本實驗在實驗室前期研究的基礎上，將納米羥基磷灰石、膠原蛋白與絲素蛋白的質量比分別設為1∶1∶5、1∶2∶5、1∶3∶5，采用冷凍干燥法制備復合支架，以期探索符合骨組織工程支架材料的納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白最佳配比。
1材料和方法Materials and methods
設計：材料學觀察實驗。
時間及地點：于2012年10月至2013年7月在解放軍軍事醫學科學院衛生裝備研究所實驗室完成。
材料：納米羥基磷灰石(南京埃普瑞公司)；Ⅰ型膠原溶液自制[23]；絲素蛋白(浙江嘉興)。MC3T3-E1細胞為本實驗室長期凍存。
實驗方法：
納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白復合支架材料的制備：將納米羥基磷灰石、膠原蛋白與絲素蛋白分別按質量比1∶1∶5、1∶2∶5、1∶3∶5充分混合，移入24孔板中，4 ℃冰箱保存2 h，-20 ℃冰箱過夜，最后用冷凍干燥機冷凍干燥得到納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白復合支架。將支架放入無水乙醇中浸泡24 h，0.1 mol/L氫氧化鈉處理1 h后，去離子水清洗干凈，得到納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白復合三維支架。
納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白復合支架材料性能測試：
電鏡觀察：將各組支架冷凍干燥，噴金，掃描電鏡觀察其超微結構，并測其孔徑大小。
孔隙率測定：采用改良的液體位移法測定支架孔隙率，將各組支架分別浸入體積為V1的無水乙醇量筒
中，負壓脫氣至支架無氣泡逸出，記錄此時乙醇體積為V2，取出支架樣品，剩余乙醇體積為V3，計算孔隙率。每組測3個樣品，取平均值。
孔隙率(%)=(V1-V3)/(V2-V3)×100%
吸水膨脹率測定：取各組干燥支架，稱質量記m1，浸入PBS中24 h取出，用濾紙吸干表面的水分稱質量記m2，計算吸水膨脹率。每組測3個樣品，取平均值。
仿生復合骨組織工程支架材料生物相容性實驗的試劑與儀器：
試劑與儀器來源
α-MEM 培養液GIBCO公司，美國
胎牛血清蘭州民海生物工程有限公司
3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基
四氮唑溴鹽(MTT液)、胰酶
天津百若克公司
超凈工作臺SW-CJ-1F型蘇州凈化設備公司
CO2細胞培養箱3111型Forma公司
倒置顯微鏡及照相系統日本Olympus公司
Instron5865力學試驗機Instron公司，美國
細胞培養瓶Corning公司，美國
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吸水膨脹率(%)=(m 2-m 1)/m 1×100%
壓縮力學性能：取外觀完好的支架，浸入PBS 中24 h 后取出，測得其直徑為1.4 cm 、高度1.0 cm ，然后將支架置于Instron5865力學試驗機載物臺處，啟動機器，設置參數為壓縮應變10%、循環3周期載荷，測定支架的壓縮力學性能。
細胞生物相容性檢測：將性能測試結果較好比例的三維支架裁剪成直徑4 mm 、高度2 mm 的圓柱狀，滅菌處理
后用α-MEM 培養液浸泡24 h 后備用。將MC3T3-E1細胞制成濃度為1×1010 L -1的細胞懸液，用吸管將6孔板中三維支架材料內的培養液吸干，采用反復滴加法在每片支架上滴加細胞懸液，直至支架不再吸液為止。置入體積分數5%CO 2、37 ℃孵箱內4 h 后，沿6孔板壁緩慢滴加完全培養液3 mL ，放入孵箱內培養，以后每2 d 換液1次。
MTT 細胞活性檢測：分別于2，4，6，8，12 d 各取出3片，棄去原培養液，分別加入2%MTT 液
1 mL ，置于孵箱
圖1 納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白支架大體觀 Figure 1 General view of nano-hydroxyapatite/collagen/silk fibroin scaffolds
圖注：呈乳白色，表面光滑，有彈性，壓縮可變形，去除外力后可自動恢復至原狀。
圖2 掃描電鏡觀察納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白支架(×100) Figure 2 Scanning electron microscope image of
nano-hydroxyapatite/collagen/silk fibroin scaffolds (×100) 圖注：支架具有不規則的多孔結構，交通孔豐富、相通性好。
圖3 質量比1∶2∶5納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白支架的壓縮應力-應變圖 Figure 3 Compressive stress-strain image of
nano-hydroxyapatite/collagen/silk fibroin (1:2:5) scaffolds 6 5 4 3 2 1
壓縮應力(k P a )
-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
壓縮應變(%)
圖4 MC3T3-E1細胞與質量比1∶2∶5納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白支架復合培養的蘇木精-伊紅染色圖片(×40) Figure 4 Hematoxylin-eosin staining of MC3T3-E1 cells eded onto the nano-hydroxyapatite/collagen/silk fibroin (1:2:5) scaffolds (×40) 圖注：圖中A -C 分別為復合培養的2，6，8 d ，細胞與支架材料黏附生長良好，細胞形態、生長狀況未受支架材料影響。
A
B
C
圖5 MC3T3-E1細胞接種到質量比1∶2∶5納米羥基磷灰石/膠原
蛋白/絲素蛋白支架后8 d 的細胞組織復合物電鏡圖
Figure 5 Electron microscope image of MC3T3-E1 cells eded onto nano-hydroxyapatite/collagen/silk fibroin (1:2:5) scaffolds for 8 days
圖注：支架材料內部有大量細胞長入，細胞黏附、生長良好。
試樣1 試樣2 試樣3
內4 h，取出后，每孔內滴加DMSO液1 mL，用吸管反復吹打支架約1 min，取96孔板，每孔內用吸液槍滴加150 μL，于490 nm波長下測其吸光度值(A值)；另取培養8 d的復合物作電鏡及蘇木精-伊紅切片染色。
主要觀察指標：觀察納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白復合支架的理化性質、壓縮力學性能，以及細胞生物相容性。
統計學分析：采用SPSS 16.0統計軟件包進行分析。數據以x_±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P < 0.05為差異有顯著性意義。
2結果Results
2.1 納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白三維支架材料大體觀察納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白復合支架外觀呈乳白色，表面光滑，有彈性，壓縮可變形，去除外力后可自動恢復至原狀，見圖1。
2.2 納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白混合支架掃描電鏡觀察納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白材料具有不規則的多孔結構，交通孔豐富、相通性好，孔徑98-260 μm，各組平均孔徑見表1，總的平均孔徑為167 μm，孔隙率為(96.72±
3.78)%，見圖2。
2.3 納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白支架孔隙率及吸水膨脹率測定結果通過不同的比例混合，測得各組納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白材料孔隙率和吸水膨脹率隨著膠原蛋白混合的比例增大呈現下降趨勢，見表1，結果顯示1∶2∶5的混合比例支架孔隙率及吸水膨脹率較佳。2.4 納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白支架的壓縮力學性能將外觀完好的支架置于Instron5865力學試驗機載物臺處，啟動機器，設置相應參數，測試支架壓縮力學性能，其結果顯示混合支架材料的平均彈性模量(楊氏模量，壓縮應變2%-8%)為3
3.59 kPa，見表2；其壓縮的應力應變曲線見圖3。
2.5 復合支架的細胞相容性將MC3T3-E1細胞與所制備的三維支架材料(質量比為1∶2∶5)復合培養后，
分別于2，6，8 d取出細胞/支架復合物，經固定處理、制成切片，蘇木精-伊紅染色后，鏡下見細胞與支架材料黏附生長良好，細胞形態、生長狀況未受支架材料影響，見圖4。
細胞在支架內增殖的數量隨著培養周期的延長而增多，取8 d細胞組織復合物做電鏡觀察，發現支架材料內部有大量細胞長入，細胞黏附、生長良好，見圖5。
細胞與質量比1∶2∶5納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白支架復合培養2，4，6，8，12 d的吸光度值(A值)，見表3；可見A值均隨培養時間增加而增大，前1周細胞增長迅速，后期細胞增殖相對較緩慢，因此生長曲線呈S形，見圖6。
3討論Discussion
為了促進骨生成種子細胞對支架材料的識別、黏附、表2 質量比1∶2∶5納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白混合支架的彈性模量
Table 2 Elasticity modulus of nano-hydroxyapatite/collagen/silk fibroin (1:2:5) scaffolds
表1 不同混合比例納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白支架的孔徑、孔隙率及吸水膨脹率(x_±s) Table 1 Average pore size, porosity and water absorption of
nano-hydroxyapatite/collagen/silk fibroin scaffolds in different
mixing ratios
納米羥基磷灰石、
膠原蛋白與絲素
蛋白的混合比例
孔徑(μm)孔隙率(%) 吸水膨脹率(%)
1∶1∶5 228±4 98.34±1.23 596.69±38.71 1∶2∶5 157±3 96.72±2.78 549.37±35.29 1∶3∶5 97±2 92.53±2.85 499.52±32.61 樣本壓縮位移(mm) 壓縮應力(MPa) 彈性模量(kPa)
1 1.235 07 0.005 10 32.051 79
2 1.286 6
3 0.005 47 37.283 68
3 1.400 71 0.005 40 31.438 62
平均值 1.307 47 0.005 32 33.591 36
標準方差0.084 76 0.000 20 3.212 30
表3 質量比1∶2∶5納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白支架與MC3T3-E1細胞復合培養不同時間點的A值
Table 3 MTT values of MC3T3-E1 cells eded onto
nano-hydroxyapatite/collagen/silk fibroin (1:2:5) scaffolds at different time points
時間樣本1 樣本2 樣本3
2 d 0.310 16 0.324 65 0.33
3 56
4 d 0.441 4
5 0.425 33 0.461 68
6 d 0.728 46 0.746 21 0.69
7 25
8 d 12 d 1.086 54
1.212 35
1.100 31
1.300 23
1.0643 86
1.242 353
圖6 MC3T3-E1細胞在質量比1∶2∶5納米羥基磷灰石/膠原蛋白/
絲素蛋白支架上的生長曲線
Figure 6 Growth curve of MC3T3-E1 cells eded onto
nano-hydroxyapatite/collagen/silk fibroin (1:2:5) scaffolds
圖注：A值均隨培養時間增加而增大，前1周細胞增長迅速，后期細
胞增殖相對較緩慢，因此生長曲線呈S形。
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
A
2 d 4 d 6 d 8 d 10 d 12 d
樣本1 樣本2
樣本3
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增殖及形成新的骨細胞外基質，作為骨組織工程中關鍵因素的支架材料，不僅材料的特性，而且其結構特征都應與骨細胞生長的天然細胞外基質環境盡可能的相似[15]。
有研究表明，作為組織工程生物支架材料應具有以下性能[4，16]：①良好的生物相容性、穩定性，除滿足生物材料的一般要求外，材料本身應對細胞無毒副作用。②良好的生物機械性能，對于承擔負荷的組織工程的支架材料，必須具備足夠的力學性能。③良好的生物降解性，對于良好的組織工程支架材料而言，要求生物材料的降解速率可以根據需要進行適當的調整。④良好的材料-細胞界面，應有利于細胞黏附、生長。⑤應能夠做成三維立體多孔結構，這種結構可以提供更大的表面積和空間，以利于細胞黏附生長，并且可以構建需要的組織形態。
本實驗制備的支架材料，壓縮可變形，有一定壓縮彈性，去除外力后可自動恢復至原狀，可根據需要制備成不同三維形狀及不同體積大小，能夠滿足骨組織工程試驗對支架材料的最基本要求。
空白支架掃描電鏡發現3種比例支架均具有不規則的多孔結構，但隨著膠原蛋白含量的增加，支架材料孔徑逐漸變小；反之，隨著膠原含量下降，支架材料孔徑逐漸增大，而支架孔徑過大過小都不能滿足種子細胞黏附、長入及增殖[17-18]。在納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白質量比為1∶2∶5時，交通孔豐富、相通性好，孔徑98-260 μm，總的平均孔徑為167.82 μm，孔隙率為(549.37±35.29)%。根據接種細胞種類及支架材料的性能不同，對支架孔徑大小和孔隙率的要求并非嚴格一致，但目前觀點認為支架孔隙率越高[19]，支架孔徑與所植入細胞體積及細胞生長形態相匹配[20]，可能越是性能良好的組織工程支架。
有文獻報道，密質骨的壓縮模量和壓縮強度分別為7-30 GPa、100-230 MPa，而松質骨的壓縮模量和壓縮強度分別是0.05-0.5 GPa、2-12 MPa[21]。本實驗所制備的支架材料具有一定的壓縮模量和壓縮強度，在作為骨缺損修復時該材料具有一定的支撐能力。從圖3可見，隨機取出3個樣本，其壓縮應力應變曲線幾乎完全一致，說明其可重復性高，所得結果可靠。
從以上各項指標的數據綜合分析，由于納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白按質量比為1∶2∶5時，其孔隙率、孔徑及壓縮彈性等相應參數性能符合組織工程骨組織的構建要求，說明本實驗制備的支架材
料從物理性能上可以用于骨組織工程實驗。但是用作組織工程支架，對細胞無毒無害，具有良好的生物相容性至關重要。
細胞毒性實驗是評價生物材料生物相容性的指標之一。本實驗采用MTT比色法[22]，即細胞生長抑制法進行細胞活性評價。該方法的原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在490 nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數呈正比。該方法靈敏度高，經濟實用，為目前實驗常用檢測細胞活性的手段。
由圖6可見，細胞生長曲線呈現S型，符合目前細胞-支架培養的一般規律，即經過前期細胞黏附適應后，細胞進入對數生長期，曲線斜率突然增大；當細胞增殖到一定程度后，由于支架體積及營養、代謝等因素，細胞增殖開始減緩。根據GB/T 16886.5-2003中規定的細胞毒性分級標準[23-35]，該實驗材料的細胞相對增殖度均大于85%，結果診斷合格，表明該材料幾乎不具有細胞毒性。
細胞-支架復合物培養2，6，8 d后進行石蠟切片蘇木精-伊紅染色，如圖4可見第2天時支架內細胞數量很少，待第8天時可見細胞數量倍增，支架內部可見大量細胞。而細胞-支架培養8 d的掃描電鏡可見，支架內部孔洞內大量細胞生長，細胞完全伸展、形態各異并有細胞基質分泌。此兩項結果能夠說明以下問題：該支架細胞相容性良好，對細胞無毒害作用；該支架孔徑大小及孔隙率等適宜細胞長入、增殖。
綜合以上，可以明確該納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白復合支架材料能夠滿足作為骨組織工程生物支架材料的基本要求，具有適宜的孔徑，良好的孔隙率；能夠制備成不同需要的三維立體形狀；具有良好的材料-細胞界面，有利于細胞黏附、生長；對細胞、組織無毒副作用，具有良好的生物相容性。
納米羥基磷灰石/膠原蛋白/絲素蛋白復合支架材料具有良好的三維塑形特性、良好的細胞生物相容性，有望用于大面積骨組織缺損的修復。然而，若將其作為細胞載體材料進一步用于臨床還需要深入的研究，如在不同解剖部位進行較長時間的實驗來確定其具體的生物修復功能。
致謝：感謝解放軍軍事醫學科學院及二級實驗動物房給予的實驗動物支持；感謝李暉及李瑞欣老師對實驗的指導及幫助。
作者貢獻：李瑞欣、年爭好進行實驗設計，實驗實施為年爭好、李東、徐成，實驗評估為孫凱，資料收集為年爭好，年爭好成文，李瑞欣、張西正審校，李瑞欣、李暉對文章負責。
利益沖突：文章及內容不涉及相關利益沖突。
倫理要求：動物實驗符合國家實驗動物倫理要求。
學術術語：羥基磷灰石-是天然骨無機鹽的主要成分，具有良好的骨傳導性與生物相容性，被認為是骨缺損修復的理想材料，尤其是納米級羥基磷灰石與天然骨中的無機成分相似，引入到復合材料中可使
材料在力學和生物學方面具有很大的優越性和應用潛力。但羥基磷灰石也有其自身的缺點，如生物力學強度不理想、骨誘導活性低等。
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ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH1153
