1.3 中藥的薄層色譜鑒定
內容提要
本實驗采用薄層色譜法，對大黃、人參、丹參、大青葉、馬錢子、熊膽、萬氏牛黃清心丸等常用中藥進行品種鑒定或質量控制。
通過實驗掌握含有不同類別化學成分中藥薄測色譜鑒別的條件關鍵技術。掌握熊膽等中藥薄層色譜鑒定的特征和方法。
原理
薄層色譜鑒定法是選用適當粒度的吸附劑，并將其均勻涂鋪在玻璃板上(或其他支持物上，如鋁制薄板)成一薄層，然后用毛細管或適當的點樣器將供試品和對照品溶液分別滴加在薄層的啟始線上，待樣點上的溶劑揮散后，置于密閉的層析缸中，用一定的溶劑展開，當溶劑前沿到達距離另一端2～3cm處，取出，干燥，顯色或直接觀察（有色成分），并與專屬性的化學對照品或對照藥材相比較，以鑒定品種或質量。薄層色譜鑒定法是中藥鑒定應用范圍最廣的方法之一。
儀器、材料與試劑
(1)儀器與材料
1)儀器電吹風，硅膠G薄層板，硅膠H-CMC-Na薄層板，容量瓶，三角瓶，燒杯，水浴鍋，索氏提取器，紫外分析燈，層析缸。
2)材料粉末：大黃，人參，丹參，大青葉，馬錢子，熊膽，萬氏牛黃清心丸。
（2）試劑 10%磷鉬酸乙醇溶液，10%硫酸乙醇溶液，2%三氯化鐵乙醇溶液，20%氫氧化鈉溶液，30%硫酸乙醇溶液，pH試紙，氨水，苯，冰醋酸，丙酮，醋酸，醋酸乙酯，碘化鉍鉀試液，丁酮，硅藻土，甲苯，甲醇，甲酸，甲酸，甲酸乙酯，氯仿，石油醚（30～60℃），鹽酸，乙醇，乙醚，異丙醇，異辛烷，蒸餾水，正丁醇，正己烷。
（3）對照品 大黃對照藥材，大黃酸，丹參對照藥材，丹參酮ⅡA，膽酸，靛藍，靛玉紅，鵝去氧膽酸，士的寧，黃連對照藥材，黃芩苷，馬錢子堿，去氧膽酸，人參皂苷R g1、R e、R b1，熊去氧膽酸，鹽酸小檗堿，梔子苷。
操作步驟
（1）大黃的鑒定
1）供試品溶液的制備取大黃粉末 0.1 g，加甲醇20 mL浸漬 1h，濾過，取濾液 5 mL，蒸干, 加水10 mL，使溶解，再加鹽酸 l mL，置水浴上加熱 30 min，立即冷卻，用乙醚分2次提取，每次20 mL，合
并乙醚液，蒸干, 殘渣加氯仿 l mL使溶解。
2）對照藥材溶液的制備另取大黃對照藥材按照上法制備。
3）對照品溶液的制備取大黃酸對照品，加甲醇制成每 l mL含 l mg的溶液。
4）色譜條件硅膠H-CMC-Na薄層板。展開劑：石油醚（30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上層溶液。點樣量：3種溶液各4 μL。顯色：365nm紫外光燈，或氨氣中熏后在日光下觀察。
5）結果 供試品與對照藥材均顯5個橙黃色熒光斑點，對照品顯橙黃色熒光斑點；氨氣熏后斑點均變為紅色。
（2）人參的鑒定
1）供試品溶液的制備取人參粉末1g，加氯仿40mL，加熱回流1h，棄去氯仿液，藥渣揮干溶劑，加水0.5mL拌勻濕潤后，加水飽和的正丁醇10mL，超聲處理30min，吸取上清液，加3倍量的氨試液，搖勻，放置分層，取上層液蒸干，殘渣加甲醇1mL使溶解。
2）對照藥材溶液的制備取人參對照藥材1g，同上法制備。
3）對照品溶液的制備取人參皂苷R g1、R e、R b1為對照品，加甲醇制成1mL中各含2mg 的混合液。
4）色譜條件硅膠G薄層板（厚500μm）。展開劑：氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）10℃以下放置的下層溶液。顯色：10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，日光及365nm紫外光燈下觀察。點樣量：3種溶液各1~2μL。
5）結果 供試品與對照品在日光下顯3個相同的紫紅色斑點，紫外光燈（365nm）下顯相同的1個黃色和2個橙色熒光斑點。
（3）丹參的鑒定
1）供試品溶液的制備 取丹參粉末1g，加乙醚5mL，置具塞試管中，振搖，放置1h，濾過，濾液揮干，殘渣加醋酸乙酯1mL使溶解。
2）對照藥材溶液的制備 取丹參對照藥材，同上法制備。
3）對照品溶液的制備 取丹參酮ⅡA對照品，加醋酸乙酯制成每1mL含2mg的溶液。4）色譜條件 硅膠G薄層板。展開劑：苯-醋酸乙酯(19∶1)。點樣量：上述3種溶液
各5μL。展開后直接觀察。
5）結果供試品與對照品顯相同的暗紅色斑點。
（4）大青葉的鑒定
1）供試品溶液的制備 取大青葉粉末0.5g，加氯仿20mL，置水浴上回流提取1h，濾過，濾液濃縮至1mL。
2）對照品溶液的制備 取靛藍、靛玉紅對照品，加氯仿制成每1mL各含1mg的混合溶液。
3）色譜條件 硅膠G薄層板。展開劑：苯-氯仿-丙酮(5∶4∶1)。點樣量：上述2種溶液各5μL。展開后直接觀察。
4）結果 供試品與對照品顯相同顏色的斑點，靛藍顯藍色、靛玉紅淺紫紅色。
（5）馬錢子的鑒定
1）供試品溶液的制備取馬錢子粉末0.5g，加氯仿-乙醇（10∶1）混合液5mL，與濃氨試液0.5mL，密塞，振搖5min，放置2h，濾過。
2）對照品溶液的制備取士的寧和馬錢子堿對照品，加氯仿制成每1mL各含2mg的溶液。
3）色譜條件硅膠G薄層板上。展開劑：甲苯-丙酮-乙醇-濃氨（4∶5∶0.6∶0.4）。顯色：碘化鉍鉀試液。點樣量：上述3種溶液各10μL。
4）結果供試品與對照品顯相同的棕色斑點。
（6）熊膽的鑒定
1）供試品溶液的制備取熊膽仁0.1g，加甲醇10mL，溫熱使溶解，放冷，濾過，濾液濃縮近干，加20%氫氧化鈉溶液5mL，水浴水解5h，放冷，加鹽酸至pH 2～3，加醋酸乙酯萃取2次，合并醋酸乙酯液，濃縮至約5mL。
2）對照品溶液的制備取膽酸、熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸及去氧膽酸各約1mg，分別加甲醇1mL溶解。
3）色譜條件硅膠G薄層板。展開劑：異辛烷-乙醚-冰醋酸-正丁醇-水（10:5:5:3:1）的上層液。展距：16～18cm。顯色：30%硫酸乙醇溶液，105℃烘10min。
4）結果供試品應有與熊去氧膽酸相同的斑點。
（7）萬氏牛黃清心丸的鑒定
1）取萬氏牛黃清心丸3g，剪碎，加硅藻土0.6g，研勻，加氯仿10mL、冰醋酸0.5mL，回流30min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇2mL使溶解，濾過，濾液作為供試品溶液。另取膽酸對照品，加乙醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述2種溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層
板上，以醋酸乙酯-正己烷-醋酸-甲醇（32∶6∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，在110℃加熱約10min。供試品色譜在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
2）取萬氏牛黃清心丸3g，剪碎，加硅藻土0.5g，研勻，加甲醇20mL，回流1h，放冷，濾過，濾液作為供試品溶液。另取黃芩苷對照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述2種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G-CMC-Na薄層板上，以醋酸乙酯-丁酮
-甲酸-水（5∶3∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
3）取萬氏牛黃清心丸3g，加乙醚15mL，研磨，棄去乙醚。殘渣揮干乙醚，加醋酸乙酯30mL，回流提取1h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇3mL使溶解，濾過，濾液作為供試品溶液。另取梔子苷對照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述2種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水（10∶7∶2∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱約10min。供試品色譜在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
4）取萬氏牛黃清心丸適量，剪碎，取4g，精密稱定，置索氏提取器中，加鹽酸-甲醇（1∶100）適量，回流提取至提取液無色，提取液移至50mL量瓶中，用鹽酸-甲醇（1∶100）稀釋至刻度，搖勻。
取提取液4mL，置水浴上蒸干，殘渣加甲醇溶解，使成1mL，作為供試品溶液。另取黃連對照藥材50mg，加甲醇10mL，置水浴上回流15min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1mL使溶解，作為對照藥材溶液。再取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述3種溶液各2μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以苯-醋酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液（12∶6∶3∶3∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下觀察。供試品色譜在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的黃色熒光斑點；在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的黃色熒光斑點。
要點及難點解答
（1）各類成分進行薄層色譜鑒定的必備條件供試品的提取方法，吸附劑，展開劑，顯色劑或顯色方法，對照品或對照藥材。供試品與對照品或對照藥材必須在相同色譜條件下進行展開，展距在無特殊規定情況下一般為10cm。
（2）硅膠H-CMC-Na為硅膠H羧甲基纖維素鈉薄層板。
（3）在有對照品的情況下，薄層色譜鑒定可用于測定中藥中有效成分或有害物質的近似含量，以控制中藥的質量。若對色譜斑點進行薄層掃描，即可較準確地測定其化學成分的含量。
（4）影響薄層色譜鑒定質量因素較多，其關鍵技術參見附錄。
（5）萬氏牛黃清心丸的處方組成為：牛黃、朱砂、黃連、黃芩、梔子、郁金，注意分析上述色譜鑒別所用的化學對照品與原料藥材的相關性。
習題與作業
（1）習題
1）按照各供試品中的化學成分，總結各類成分的進行薄層色譜鑒定的提取溶劑、吸附劑、展開劑和檢測方法。
2）用薄層色譜法鑒別大黃、人參、丹參、大青葉、馬錢子、熊膽、萬氏牛黃清心丸。
（2）作業
繪制大黃、人參、丹參、大青葉、馬錢子、熊膽、萬氏牛黃清心丸薄層色譜圖，注明色譜條件和實驗結果。
