實驗七、血清膽固醇的定量測定（磷硫鐵法）
實驗七、血清膽固醇的定量測定（磷硫鐵法）
實驗目的：
掌握磷硫鐵法測定血清膽固醇的原理、方法及臨床意義。
實驗原理：
總膽固醇的測定有化學比色法(磷硫鐵法和鄰苯二甲醛法)和酶學方法(試劑盒)兩類。本實驗采用磷硫鐵法測定血清膽固醇含量。
用無水乙醇提取血清中的膽固醇，再與硫磷鐵試劑作用，產生顏色反應，呈色度與膽固醇含量成正比，可用比色法測定血清中膽固醇含量。
血清經無水乙醇處理，蛋白質被沉淀，膽固醇及其酯溶解在無水乙醇。在乙醇提取液中，加磷硫鐵試劑，膽固醇及其酯與試劑形成比較穩定的紫紅色化合物，此物質在560nm 波長處有特征吸收峰，可用比色法作膽固醇的定量測定。正常血清中膽固醇的含量有隨年齡增大而增
加的趨勢，其平均正常值在110～220mg/100ml。
膽固醇含量在400mg/100ml內，與A（或OD）值呈良好線性關系。
實驗講授：
722型分光光度計的使用
722型分光光度計的使用
測量原理
分光光度法測量的理論依據是伯郎—比耳定律：當容液中的物質在光的照射和激發下，產生了對光吸收的效應。但物質對光的吸收是有選擇性的，各種不同的物質都有其各自的吸收光譜。所以根據定律當一束單色光通過一定濃度范圍的稀有色溶液時，溶液對光的吸收程度A與溶液的濃度c（g/l）或液層厚度b (cm) 成正比。其定律表達式A = abc（a是比例系數）。當c的單位為mol/l時，A = εbc，比例系數用ε表示，稱為摩爾吸光系數。其單
位為L·mol-1·cm-1，它是有色物質在一定波長下的特征常數。
T (透光率) = I/I0 A (吸光度) = -lgT 或 A = K·C·L (比色皿的厚度)
測定時，入射光I, 吸光系數和溶液的光徑長度不變時，透過光是根據溶液的濃度而變化的，即“K”為常數。比色皿厚度一定，“L”、“I0”也一定。只要測出A即可算出“C”?！斗止夤舛扔嫷谋眍^上，一行是透光率，一行是吸光度?！?/span>
722型分光光度計的使用
1、將靈敏度旋鈕調至“1”檔（信號放大倍率最小）。
2、開啟電源，指示燈亮，選擇開關臵于“T”，波長調至到測試用波長。儀器預熱20分鐘。
3、打開試樣室（光門自動關閉），調節透光率零點旋鈕，使數字顯示為000.0。（調節100%T旋鈕），蓋上試樣室蓋，將比色皿架處于蒸餾水校正位臵，使光電管受光，調節透光率100%旋鈕使數字顯示100.0。如顯示不到100.0，則可適當增加微電流放大的倍數。（增加靈敏度的檔數同時應重復（3）調節儀器透光率的“0”位）但盡量使倍率臵于低檔使用。這樣儀器會有更高的穩定性。
4、預熱后，按（3）連續幾次調整透光率的“0”位和“100%”的位臵，待穩定后儀器可進行測定工作。
吸光度“A”的測量
將選擇開關臵于A 。調節吸光度調零旋鈕，使得數字顯示為零，然后將被測樣品移入光路，顯示值即為被測樣品的吸光度值。
濃度C的測量
將選擇開關由“A”旋至“C”，將已標定濃度的樣品放入光路，調節濃度旋鈕，使得數字顯示為標定值，將被測樣品放入光路即可讀出被測樣品的濃度值。
使用方法
（1）預熱儀器將選擇開關臵于“T”，打開電源開關，使儀器預熱20分鐘。為了防止光電管疲勞，不要連續光照，預熱儀器時和不測定時應將試樣室蓋打開，使光路切斷。（2）選定波長根據實驗要求，轉動波長手輪，調至所需要的單色波長。
（3）固定靈敏度檔在能使空白溶液很好地調到“100%”的情況下，盡可能采用靈敏度較低的擋，使用時，首先調到“1”擋，靈敏度不夠時再逐漸升高。但換擋改變靈敏度后，須重新校正“0%”和“100%”。選好的靈敏度，實驗過程中不要再變動。
（4）調節T=0% 輕輕旋動“0%”旋鈕，使數字顯示為“00.0”，（此時試樣室是打開的）。（5）調節T=100% 將盛蒸餾水（或空白溶液，或純溶劑）的比色皿放入比色皿座架中的第一格內，并對準光路，把試樣室蓋子輕輕蓋上，調節透過率“100%”旋鈕，使數字顯示正好為“100.0”。
（6）吸光度的測定將選擇開關臵于“A”，蓋上試樣室蓋子，將空白液臵于光路中，調節吸光度調節旋鈕，使數字顯示為“.000”。將盛有待測溶液的比色皿放入比色皿座架中的其它格內，蓋上試樣室蓋，輕輕拉動試樣架拉手，使待測溶液進入光路，此時數字顯示值即為該待測溶液的吸光度值。讀數后，打開試樣室蓋，切斷光路。
重復上述測定操作1-2次，讀取相應的吸光度值，取平均值。
（7）濃度的測定選擇開關由“A”旋臵“C”，將已標定濃度的樣品放入光路，調節濃度旋鈕，使得數字顯示為標定值，將被測樣品放入光路，此時數字顯示值即為該待測溶液的濃度值。
（8）關機實驗完畢，切斷電源，將比色皿取出洗凈，并將比色皿座架用軟紙擦凈。
注意事項：
1、測量完畢，速將暗盒蓋打開，關閉電源開關，將靈敏度旋鈕調至最低檔，取出比色皿，將裝有硅膠的干燥劑袋放入暗盒內，關上蓋子，將比色皿中的溶液倒入燒杯中，用蒸餾水洗凈后放回比色皿盒內。
2、每臺儀器所配套的比色皿不可與其它儀器上的表面皿單個調換。
儀器：
722分光光度計、臺式離心機、試管及試管架、刻度吸量管或移液器等。
試劑：
（1）10％三氯化鐵溶液：10gFeCl3.6H2O (A.R) 溶于磷酸 (A.R)，定容至100ml。儲于棕色瓶，冷藏。
（2）磷硫鐵試劑：取10％FeCl3溶液1.5ml于100ml棕色容量瓶內，加濃硫酸 (A.R)至刻度。
（3）膽固醇標準儲液：準確稱取膽固醇80mg，溶于無水乙醇，定容至100ml。
（4）膽固醇標準溶液：將儲液用無水乙醇準確稀釋10倍即得。每毫升含0.08mg膽固醇。
（5）無水乙醇 (A.R)、無水乙醇 (A.R)。
操作
（1）吸取血清0.1ml于干燥離心管，先加無水乙醇0.4ml，搖勻后再加無水乙醇2.0 ml，搖勻，10分鐘后離心（3000rpm 離心5 min），上清液備用（分兩次加入乙醇的目的是使作用完全）。
（2）取干燥試管3支，編號，分別加入無水乙醇1.0ml（空白管）、膽固醇標準溶液1.0ml（標準管）、上述乙醇提取液1.0ml（樣品管），各管皆加入磷硫鐵試劑1.0ml，搖勻，10分鐘后，分別轉移至0.50 cm光徑的比色杯內，用分光光度計560nm比色。
硫磷鐵試劑須沿管壁緩緩加入，與乙醇液分成兩層，立即迅速振搖20次，放臵10分鐘（冷卻至室溫）后，于560nm 進行比色，以空白管調零讀取各管吸光度。
計算
（1）通過制作標準曲線來求得血清膽固醇的含量。
（2）因膽固醇含量在400mg/100ml 內，與A （或OD ）值呈良好線性關系，可由吸光
值A 的比值求其含量1
212C C A A =，本實驗即用此法。 （3）如按方法1使用血清為樣品，亦可根據線性關系計算
血清膽固醇mg%=20004.010008.0100/1212=
A A A A ml mg ＝血清膽固醇 A 2=標準液吸光值；A 1=樣品液吸光值
注意事項：
1、顏色反應與加硫磷鐵試劑混合時的產熱程度有關，因此，所用試管口徑及厚度要一致：加硫磷鐵試劑時必須與乙醇分成兩層，然后混合，不能邊加邊搖，否則顯色不完全；硫磷
鐵試劑要加一管混合一管，混合的手法，程度也要一致；混合時試管發熱，注意勿使管內液體濺出，以免損傷衣服、皮膚、眼睛。
2、所用試管和比色杯均須干燥，濃硫酸的質量很重要，放臵日久，往往由于吸收水分而使顏色反應降低。
3、空白管應接近無色，如帶橙黃色，表示乙醇不純，應用去醛處理。
4、人血清膽固醇正常含量為2.8-5.9mmol/L(110-230mg/dl)。計算公式中的0.026為mg/dl 轉換成mmol/L 的系數。
