25601207_野生動物源腸桿菌科細菌鑒定及同源性分析

2023年12月3日發(作者：家國情懷是什么意思)

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浙江畜牧獸醫２０２１年第５期野生動物源腸桿菌科細菌鑒定及同源性分析劉龍海，黃淑芳，應志豪，張秀秀，陳玎玎，龔利洋，鄭應婕（杭州動物園，浙江杭州３１０００８）摘要：本文主要對２０２０－２０２１年間分離自杭州動物園患病動物、死亡動物的腸桿菌科細菌進行鑒定和６ＳｒＤＮＡ技術鑒定細菌種類、通過ＭＡＧＡ６．０方法對１６ＳｒＤＮＡ擴增序列構建系統發生同源性分析。通過１樹，并結合ＥＲＩＣＰＣＲ指紋圖譜技術來分析分離的腸桿菌科細菌的同源性。結果共分離保存菌株３８株，經１６ＳｒＤＮＡ鑒定，其中克雷伯氏菌４株，埃希氏菌２７株，摩氏摩根菌２株，沙門氏菌１株，弗氏檸檬酸桿菌１株，哈夫尼氏菌２株，勒克氏菌１株；對埃希氏菌屬構建系統發生樹顯示，置信度在９０％可分為２３個亞群，其中Ｅ１和Ｅ２６，Ｅ５、Ｅ６、Ｅ１７和Ｅ１８，從進化關系上看更接近，通過ＮＴＳＹＳｐｃ２．０軟件對ＥＲＩＣＰＣＲ指紋圖譜分析，在相似系數為０．８７時，埃希氏菌屬可分為１８個亞群。該研究通過對杭州動物園野生動物源腸桿科細菌鑒定，以及采用ＥＲＩＣＰＣＲ對埃希氏細菌的同源鑒定，結果表明臨床埃希氏菌屬細菌感染非同株菌感染引發，這對臨床疾病預防和腸桿菌科細菌快速分類有一定的指導意義。關鍵詞：腸桿菌科細菌；鑒定；同源分析中圖分類號：　文章編號：Ｓ８５５．１＋２　文獻標識碼：Ａ１００５－７３０７（２０２１）０５－０００４－００４　　腸桿菌科細菌廣泛存在于人、動物和自然環境中，腸桿菌科細菌的致病性差異很大，大多數種類為條件性致病菌，可附殖于健康動物的體表和消化道，也有部分細菌為致病性菌，如沙門桿菌屬、志賀桿菌屬［１］ＥＲＩＣＰＣＲ分析，結果發現空氣分離菌來自于糞９］便［；Ｓｏｌｔａｎｉ等通過凝膠電泳從９５個樣本中識別出６５個不同的禽大腸桿菌菌株，其中有２３２～２６９０ｂｐ條帶，并在廉價和簡單的分子工具中證實ＥＲＩＣ１０］ＰＣＲ是一種很好的細菌基因分型技術［。在其他。革蘭氏陰性桿菌，特別是大腸埃希氏屬是引起園內感染最常見細菌之一，常引發泌尿道感染、腸２］炎、腦膜炎、敗血癥等［。在野生動物上，腸桿菌科細菌的基因分型中，也有研究驗證了ＥＲＩＣＰＣＲ的可行性，李鵬等根據副豬嗜血桿菌１５種血清型的特異性ＥＲＩＣ指紋圖譜，對中國東南部不同豬場的１１１株副豬嗜血桿菌樣品進行鑒定，驗證了ＥＲＩＣ１１］ＰＣＲ在其他細菌基因型分型的應用［。細菌極易感染哺乳動物和禽類，特別是幼齡動物，且３］。死亡率較高［基于生化反應和抗原構造的分類方法，可將腸桿菌科細菌分為５個族１２個屬，而通過生化反應和ＤＮＡ數據分析，分類更加準確細化，可將其分為２５個屬［４］１　材料與方法１．１　材料１．１．１　菌株　從患病野生動物的患處膿液、死亡動物內臟、野生動物生活環境中經分離的細菌，經生化鑒定的腸桿菌科細菌３８株。１．１．２　培養基及試劑　生化鑒定試劑盒、營養肉湯培養基、麥康凱培養基、營養瓊脂培養基、細菌ＤＮＡ提取試劑盒、細菌１６ＳｒＤＮＡ擴增試劑盒（大連寶生物工程有限公司）、超純水、５０×ＴＡＥ緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）、ＰｒｅｍｉｘＴａｑ（大連寶生物有限公司）。１．１．３　儀器設備　恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）、ＰＣＲ儀（賽默飛世爾科技）、電泳儀（北京六一有限公司）凝膠成像儀（北京科銳創新科技有限公司）、微量移液槍（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）。。１６ＳｒＤＮＡ聚合酶鏈式反應是目前細菌鑒ＣＢＩ基因數據定中最為準確、高效的手段，通過與Ｎ庫中的已知菌株數據作對比，可快速確定細菌種類［５－６］。同種腸桿菌的亞型分類對腸桿菌遺傳進化和溯源有重要意義，主要的方法有血清型分型法、基因重復序列聚合酶鏈式反應（ＥＲＩＣＰＣＲ）、脈沖場凝膠電泳（ＰＦＧＥ）、多位點序列分型（ＭＬＳＴ）、基質輔助激光解吸飛行時間質譜（ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ）等［７］。其中，ＥＲＩＣＰＣＲ技術以其操作簡單、試驗重［８］復性高和分辨力強等優點而被廣泛利用，常用于腸道菌群和細菌的同源性分析。ＨｕｉｙｏｎｇＤｕａｎ等對豬場空氣和糞便分離的１２０株大腸埃希菌進行收稿日期：２０２１０７２０２０２１年第５期１．２　方法浙江畜牧獸醫計，上游引物為：５′ＡＴＧＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＡＴＴＣＡＣ；下游引物為：５′ＡＡＧＴＡＡＧＴＧＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＧ３′。反應條件為９４℃預變性５ｍｉｎ；９４℃變性ＣＧ３′４５ｓ，５５℃復性４５ｓ，７２℃延伸３ｍｉｎ，３０個循環，７２℃延伸１０ｍｉｎ。對擴增產物使用１％的瓊脂糖凝膠進行電泳。２　結果２．１　腸桿菌科細菌１６ＳｒＤＮＡ鑒定結果　３８株腸桿菌科細菌的１６ＳｒＤＮＡ擴增片段（部分）瓊脂糖凝膠電泳圖如圖１所示。１．２．１　細菌ＤＮＡ的提取　使用Ｔａｋａｒａ公司，細菌ＮＡ。提取試劑盒提取保存細菌的Ｄ１．２．２　１６ＳｒＤＮＡ和ＥＲＩＣＰＣＲ擴增　使用Ｔａｋａｒａ公司的細菌１６ＳｒＤＮＡ的鑒定試劑盒，擴增保存腸ＮＡ的１６ＳｒＤＮＡ序列，對擴增ＰＣＲ產物使用桿菌Ｄ１％的瓊脂糖凝膠進行電泳，檢驗是否擴增成功。將擴增產物送華大基因（北京）測序，并將結果在ＮＣＢＩ數據庫中比對。用于ＥＲＩＣＰＣＲ擴增的引物序列參照文獻設圖１　３８株腸桿菌科細菌的１６ＳｒＤＮＡ擴增片段（部分）瓊脂糖凝膠電泳圖注：Ｍ：２０００ｂｐＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１－２４：腸桿菌科細菌１６ＳｒＤＮＡ擴增片段　　擴增片段經華大基因公司（杭州）測序后，將測序結果與ＮＣＢＩ數據庫已有序列比對，結果發現克雷伯氏菌４株，埃希氏菌２７株，摩氏摩根菌２株，沙門氏菌１株，弗氏檸檬酸桿菌１株，哈夫尼氏菌２株，勒克氏菌１株，如表１所示。使用ＭＥＧＡ６．０軟件，對２７株埃希氏菌１６Ｓ結果如圖２ｒＤＮＡ序列使用臨近法構建系統發生樹，所示。表１　腸桿菌科細菌１６ＳｒＤＮＡ鑒定結果菌株種類克雷伯氏菌埃希氏菌摩氏摩根菌沙門氏菌弗氏檸檬酸桿菌哈夫尼氏菌勒克氏菌數量（ｎ＝３８）４２７２１１２１比例／％１４．８７１．１５．３２．６２．６５．３２．６圖２　２７株埃希氏菌１６ＳｒＤＮＡ序列系統發生樹浙江畜牧獸醫２０２１年第５期　　從構建的系統發生樹中發現，置信度在９０％可３個亞群，其中Ｅ１和Ｅ２６，Ｅ５、Ｅ６、Ｅ１７和分為２Ｅ１８，進化關系較近。２．２　埃希氏菌ＥＲＩＣＰＣＲ指紋圖譜　對ＥＲＩＣＰＣＲ擴增產物，使用１％的瓊脂糖凝膠進行電泳，部分結果如圖３所示。圖３　埃希氏菌ＥＲＩＣＰＣＲ擴增產物（部分）注：Ｍ：２０００ｂｐＤＮＡｍａｒｋｅｒ；Ｅ１－Ｅ２０：埃希氏菌ＥＲＩＣＰＣＲ擴增產物　　通過對電泳條帶統計，每株埃希氏桿菌擴增出０－８條條帶，共擴增出不同條帶１１種，其中Ｅ５、Ｅ１４、Ｅ１６未擴增出條帶，使用ＮＴＳＹＳｐｃ２．０軟件，對擴增條帶進行遺傳相似度分析，結果如圖４所示。圖４　埃希氏菌ＥＲＩＣＰＣＲ指紋圖譜遺傳相似度分析　　通過對ＥＲＩＣＰＣＲ指紋圖譜分析，在相似系數為０．８７時，埃希氏菌屬可分為１８個亞群，其中Ｅ１和Ｅ２２，Ｅ６和Ｅ７，Ｅ８和Ｅ２３，Ｅ２６和Ｅ２７，Ｅ１７和Ｅ１８遺傳相似度較高。３　討論１６ＳｒＤＮＡ基因是原核生物核糖體小亞基ｒＤＮＡ（１６ＳｒＤＮＡ）的基因，是細菌分類學研究中最常用、最有用的“分子鐘”，全長序列包含１０個可變區，可精確指示細菌之間的親緣關系，所含信息能反應生物界進化關系，易操作，適用于各級分類單元。本研究，通過擴增腸桿菌的１６ＳｒＤＮＡ的全長序列、測序和比對，確定了臨床分離細菌７個屬３８株腸桿菌科細菌。利用１６ＳｒＤＮＡ序列信息，進一步通過ＭＥＧＡ６０軟件構建２７株埃希氏菌屬細菌系統發生樹，若把置信度定位在９０％時，則可以分為２３個亞群。在確定遺傳關系上，ＥＲＩＣＰＣＲ指紋圖譜技術比１６ＳｒＤＮＡ基１２］。本文中７７．８％（ｎ＝２１）因分析更具有鑒別性［埃希氏菌屬細菌ＥＲＩＣＰＣＲ電泳結果顯示出獨特條帶，表明菌株之間非相同菌株傳播。經遺傳聚類分析，在相似系數為０．８７時，埃希氏菌屬菌可分為１８個亞群，顯示其傳播情況為非同株菌的爆發式傳播。在本研究中，通過１６ＳｒＤＮＡ序列信息構建的系統發生樹中，置信度在９０％時，可分為２３個亞群，其中Ｅ１和Ｅ２６，Ｅ５、Ｅ６、Ｅ１７和Ｅ１８，進化關系較ＲＩＣＰＣＲ指紋圖譜分析，在相似系近；而在通過對Ｅ數為０．８７時，埃希氏菌屬菌可分為１８個亞群，其中Ｅ１和Ｅ２２，Ｅ６和Ｅ７，Ｅ８和Ｅ２３，Ｅ２６和Ｅ２７，Ｅ１７和Ｅ１８遺傳相似度較高。從兩種分析結果來看有所差２０２１年第５期浙江畜牧獸醫異。然而，在ＥＲＩＣＰＣＲ指紋圖譜分析時，在相似系．７５時，可分為１２個亞群，排除未出現條帶的數為０Ｅ５、Ｅ１４、Ｅ１６，有１個亞群包含１６ＳｒＤＮＡ序列信息構建的系統發生樹中置信度大于９０％的所有菌株。本研究中，通過細菌的１６ＳｒＤＮＡ快速鑒定細ＲＩＣＰＣＲ指紋圖譜分析快速分析菌種類，并結合Ｅ出埃希氏菌屬細菌的遺傳關系，在今后腸桿菌科細菌感染的快速鑒定、分類和遺傳溯源上有一定的指導意義。然而，在ＥＲＩＣＰＣＲ指紋圖譜分析中，Ｅ５、Ｅ１４、Ｅ１６未出現有效條帶，需進一步研究，分析原因。參考文獻［１］ＬｅｕｎｇＫＴ，ＭａｃｋｅｒｅｔｈＲ，ＴｉｅｎＹ，ｅｔａｌ．ＡｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＡＦＬＰａｎｄＥＲＩＣＰＣＲａｎａｌｙｓｅｓｆｏｒｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｆｒｏｍｃａｔｔｌｅ，ｐｉｇａｎｄｈｕｍａｎｓｏｕｒｃｅｓ［Ｊ］．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＥｃｏｌｏｇｙ，２００４，４７（１）：１１１－１１９．［２］ＭｏｏｓａｖｉａｎＭ，ＥｍａｍＮ．ＴｈｅｆｉｒｓｔｒｅｐｏｒｔｏｆｅｍｅｒｇｉｎｇｍｏｂｉｌｉｚｅｄｃｏｌｉｓｔｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅｓａｎｄＥＲＩＣＰＣＲｔｙｐｉｎｇｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｃｌｉｎｉｃａｌｉｓｏｌａｔｅｓｉｎｓｏｕｔｈｗｅｓｔＩｒａｎ［Ｊ］．２０１９，１２：１００１－１０１０．［３］那春子．野生動物大腸桿菌病的臨床表現及防治［Ｊ］．現代畜牧科技，２０１７（１１）：１１６．［４］ＢｒｅｅｄＲＳ．Ｂｅｒｇｅｙ＇ｓＭａｎｕａｌｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ［Ｍ］．１９５７．［５］方光遠，茅慧華，蔣加進，等．不同病例動物源大腸桿菌的分離鑒定及１６ＳｒＤＮＡ同源性分析［Ｊ］．中國畜牧獸醫，２０１５，４２（１２）：３１２６－３１３２．［６］蔣增海，鄧同煒，徐耀輝，等．豬源綠膿桿菌的分離鑒定６ＳｒＲＮＡ基因同源性分析［Ｊ］．河南農業科學，及１２０１７，４６（４）：１１８－１２０．［７］胡辛蘭，陳東杰，吳長生，等．４種不同方法用于院內感染肺炎克雷伯菌菌株同源性分析的價值比較［Ｊ］．臨床２０１９，３７（１）：４１－４４．檢驗雜志，［８］朱佳文，吳永勝，許禎瑩，等．ＥＲＩＣＰＣＲ技術在動物流行病學調查中的應用［Ｊ］．四川畜牧獸醫，２０１８，４５（１）：３３－３５．［９］ＤｕａｎＨ，ＣｈａｉＴ，ＬｉｕＪ，ｅｔａｌ．ＳｏｕｒｃｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｉｒｂｏｒｎｅＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｏｆｓｗｉｎｅｈｏｕｓｅｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇｓｕｓｉｎｇＥＲＩＣＰＣＲａｎｄＲＥＰＰＣＲ［Ｊ］．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９，１０９（５）：５１１－５１７．［１０］ＭｏｌｅｃｕｌａｒｔｙｐｉｎｇｏｆａｖｉａｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｉｓｏｌａｔｅｓｂｙｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃｃｏｎｓｅｎｓｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅｓｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＥＲＩＣＰＣＲ）［Ｊ］．［１１］曾文斌，劉悅欣，熊亞坤，等．２０１２～２０１４年江西地區副豬嗜血桿菌分離株ＥＲＩＣＰＣＲ指紋圖譜分析［Ｊ］．畜牧與獸醫，２０１５，４７（６）：３６－４０．［１２］ＡＹｕｎＱ，ＳｕｗａｎｔｏＡ，ＢａｒｕｓＴ．ＧｅｎｅｔｉｃＰｒｏｆｉｌｅｓｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＩｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＩｎｄｏｎｅｓｉａｎＴｅｍｐｅｈＢａｓｅｄｏｎＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌＲｅｐｅｔｉｔｉｖｅＩｎｔｅｒｇｅｎｉｃＣｏｎｓｅｎｓｕｓＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ（ＥＲＩＣＰＣＲ）［Ｊ］．，２０１５，９（２）：５８－６４．ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＩｎｄｏｎｅｓｉａ欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍（上接第３２頁）倍于平時劑量的維生素Ｄ，持續２～３周后，再恢復步診斷。如鈣缺乏的病理變化特征表現為肋骨骨質軟易彎曲、骨干內表面出現小米粒大佝僂病串珠，脛骨骺生長板增生且有輕度增寬，干骺端類骨組織和疏松結締組織輕度增生，成骨細胞和破骨細胞偏多。而磷缺乏癥的特征是肋骨和翅部長骨質軟易彎曲，脛骨骺生長板肥大有輕度增寬，干骺端肋骨組織輕度增生。若要做出確切診斷，則需對所飼喂的飲水、飼料、臟器組織等進行鈣磷含量的測定。４　預防該病的發生主要是由于飼料中鈣磷含量不足或缺乏以及鈣磷比例不當，也與飼料中維生素Ｄ的含量密切相關。對于該病的預防，如果日糧中缺鈣，應補充貝殼粉、石粉，缺磷時應補充磷酸氫鈣。鈣磷比例不平衡要調整，合理的鈣磷比例一般為２∶１，產蛋期一般為５∶１。由于鈣磷在機體內的吸收代謝需要維生素Ｄ的協同作用，故飼料中需要足量的維生素Ｄ，如果日糧中已出現維生素Ｄ缺乏現象，應給予３，因此到正常劑量。陽光可促使機體合成維生素Ｄ鵝群要保證一定的舍外運動。在陰雨季節要適當地添加維生素Ｄ制劑或富含維生素Ｄ的青綠飼料。在額外添加鈣磷時，還要注意飼料中鈣磷的供給，鈣磷的比例以及維生素Ｄ的供給，及時發現病鵝，挑出單獨飼養，減少損失。在良好的飼養條件下，不僅能滿足鵝的生長發育需要，且能有效地預防因鈣磷缺乏或比例失調引起的佝僂病。５　治療對本病的治療，首先要明確發生原因，是鈣缺乏、磷缺乏，還是鈣磷比例不當。患病鵝群可添加魚肝油１０～２０ｍｇ／ｋｇ飼料，同時調整好鈣磷比例及用量。病情嚴重的鵝群可口服魚肝油膠丸或肌內注射，每羽內服１．５萬ＩＵ或維丁膠性鈣。或用維生素Ｄ３肌內注射４萬ＩＵ。也可用０．５％～１．０％劑量的魚肝油拌料。若同時服用鈣片，則效果更好。需要注意的是，維生素Ｄ不可長時間過量添加，防止中毒。

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