畢赤酵母的培養基1

2023年12月4日發(作者：校園秋色作文)

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畢赤酵母的培養

巴斯德畢赤酵母是甲醇營養型酵母中的一類能夠利用甲醇作為唯一碳源和能源的酵母菌。與其它酵母一樣，在無性生長期主要以單倍體形式存在，當環境營養限制時，常誘導2個生理類型不同的接合型單倍體細胞交配，融合成雙倍體。

比赤酵母表達常用的培養基：

1 LB培養基 胰蛋白胨 1% 酵母粉 0.5% 氯化鈉 1% PH

7.0----------------大腸桿菌培養

制作平板加入2%的瓊脂粉，121攝氏度20分鐘，可于室溫保存。

用于培養 pPICZ αA 原核宿主菌 TOP10F’時可加入 Zeocin 25ug /

mL（博來霉素，抗菌素）

宿主細胞His- -----------誘變造成的。

MD------------酵母轉化篩選培養基（營養缺陷型His-）13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖用于表達的畢赤酵母都屬于組氨酸缺陷型的只有染色體上成功整合入重組質粒載體基因的畢赤酵母菌株才能在組氨酸缺失的MD培養基生長，以此篩選出重組子。

MM--------------酵母轉化進一步篩選培養基僅能滿足微生物野生型菌株生長需要的培養基，成為基本培養基（minimal medium,MM），有時用符號“[ － ]”來表示。不同微生物的基本培養基是不相同的。

2 LLB 培養基 胰蛋白胨 1% 酵母粉 0.5% 氯化鈉 0.5% PH 7.0制作平板時加入 2％瓊脂粉。 121℃高壓滅菌 20min。 可于室溫保存數月。 用于培養 pPICZ αA 原核宿主菌 TOP10F’時，加入 Zeocin 25ug / ml，可以 4℃條件下保存 1～2 周.

3 YPD培養基 酵母粉1%，胰蛋白胨2%，葡萄糖2%，固體加2%的瓊脂粉，YPD 培養基可常溫保存,是畢赤酵母的最基本培養基，瓊脂 YPD 平板在 4℃可保存 幾個月。加入 Zeocin 100ug / ml，成為

YPDZ 培養基，可以 4℃條件下保存 1～2 周。

4 BMGY培養基

酵母粉1% 蛋白胨2%， 磷酸鉀緩沖溶液平PH 6

100mmol/L YNB（酵母氮源）1.34% 生物素（4×10

-5 ）%甘油1%，畢赤酵母誘導表達前培養基，YNB和Biotin過濾除菌。培養24小時后，一 般靜置過夜，待酵母沉淀后倒掉BMGY培養基，改換BMMY培養基，進入誘導表達階段。

5 BMMY培養基 酵母粉1% 蛋白胨2%，磷酸鉀緩沖溶液平PH 6

100mmol/L YNB 1.34% 生物素（4×10 -5 ）% 甘油1% 甲醇3%，

畢赤酵母誘導表達培養基，YNB和Biotin過濾除菌。搖瓶培養時每24小時 之后加入3%的甲醇誘導，一般誘導72小時。

6 YPDS + Zeocin 培養基 酵母粉1% 蛋白胨2% 葡萄糖2%，山梨醇1M, 瓊脂2%，博來霉素100mg/ml 不管是液體 YPDS 培養基，還是 YPDS + Zeocin 培養基，都必須存放 4℃條件下，有效 1-2周。

7 MGY培養基 34%YNB,1%甘油，4×10 -5 %生物素，將 800ml 滅菌水、100ml 的 10*YNB 母液、2ml 的 500*B 母液和 100ml 的

10*GY 母液混勻即可，4℃保存，保存期為 2 個月。

8 MGYH培養基 MGY培養基+0.004%的組氨酸 MGYH 在

1000ml 的 MGY 培養基中加入 10ml 的 100*H 母液混勻，4℃保存，保存期為 2 個月。

9 RD -5 Regeneration Dextro Medium （葡萄糖再生培養基）

（含有：1mol/L 的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10 %生物素；0.005%氨基酸） （1）. 將 186g 的山梨醇定容至 700ml，高壓滅菌；（ 2）. 冷卻后于 45℃水浴； （3）. 將 100ml 的 10*D、100ml

的 10*YNB；2ml 的 500*B；10ml 的 100*AA 等母液和 88ml 無菌 水混勻，預熱至 45℃后，與步驟 2 的山梨醇溶液混合。4℃保存。

10 RDH Regeneration Dextro Medium + Histidine （葡萄糖再生培養基 + 0.004%組氨酸） 在 RD 培養基配制的第三步中，在加入

10ml 的 100*H 母液，同時無菌水的體積減少至 78ml 即可，其余配制方法與 RD 相同。4℃保存。

11 RD 及 RDH 平板的制備 1. 將 186g 的山梨醇和 15~20g 瓊脂粉定容至 700ml，高壓滅菌；冷卻后于 60℃水浴； 2. 參照

RD/RDH 液體培養基配制的步驟 4， 100ml 的 10*D、 將 100ml

的 10*YNB； 的 500*B； 2ml 10ml 的 100*AA 等母液、 （10ml

的 100*H 母液）和 88（78）ml 無菌水混勻，預熱至 45℃ 后，與步驟 1 的山梨醇/瓊脂液混勻； 3. 迅速制備平板。4℃可保存數月。

12 RD 及 RDH 的 TOP 瓊脂的制備（常用于酵母菌的包被） 瓊脂的制備（常用于酵母菌的包被） （1）.將 186g 的山梨醇和 7.5~10g

瓊脂粉定容至 700ml，高壓滅菌；冷卻后于 60℃水浴； 瓊脂粉 60℃

（2）.參照 RD/RDH 液體培養基配制的步驟 4， 100ml 的 10*D、

將 100ml 的 10*YNB； 的 500*B； 2ml 10ml 的 100*AA 等母液、

（10ml 的 100*H 母液）和 88（78）ml 無菌水混勻，預熱至 45℃后， 與步驟 1 的山梨醇/瓊脂液混勻； （3）.將該 TOP 瓊脂置于

45℃水浴冷卻、保溫，備用。

13 MD 與 MDH -5 Minimal Dextro Medium +（Histidine） 最小葡萄糖培養基 +（ 0.004 %組氨酸） （含有：1.34%YNB； ；4*10 %

生物素；2%葡萄糖） 1. 100ml 的 10*YNB；2ml 的 500*B 和

100ml10*D 母液，用 800ml 的無菌水定容至 1000ml 即可； 2. 如配制 MDH，可在上述的 MD 中加入 10ml 的 100*H 即可； 3. 如配制平板，可無菌水的滅菌前，加入 15~20g 的瓊脂。4℃可保存數月。

14 SOC 培養基： 培養基： Trypton Yeast Extract NaCl Gluco

(1mol / L) 121℃高壓滅菌 20min，冷卻后，4℃保存。 l％ 0.5％

0.05％ 2% 母液的配置注： 母液的配置注： 10*YNB （含有硫酸銨、無氨基酸的 13.4%酵母基礎氮源培養基） 4℃保存。34g 酵母 基礎氮源培養基（無硫酸銨）+100g 硫酸銨，溶于 1000ml 水中，過濾除菌。 500*B （0.02%生物素 Biotin） 4℃保存 保存期為 1 年。20mg 的生物素 溶于 100ml 水中，過濾除菌。 100*H

（0.4%Histidine 組氨酸） 4℃保存 保存期為 1 年。400mg 的 L-組氨酸溶于 100ml 水中， （加熱至 50℃以促進溶解） ，過濾除菌。

10*D （20%Dextro 葡萄糖） 保存期為 1 年。200g 葡萄糖溶于

1000ml 水中，滅 菌 15min 或過濾除菌。 10*M 過濾除菌。

（5%Methanol 甲醇） 保存期為 2 個月。將 5ml 的甲醇與 95ml

水混勻， 10*GY （10%Glycerol 甘油） 保存期為 1 年以上。將

100ml 甘油和 900ml 水混勻 后，高壓滅菌或過濾除菌。 100*AA

過濾除菌。 （0.5% of each Amino Acid，各種氨基酸） 4℃保存 保存期為 1 年。分 別將 500mg 的 L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-賴氨酸、L-亮氨酸和 L-異亮氨酸溶于 100ml 水中， 1M 磷酸鉀溶液（potassium phosphate buffer，pH6.0） ，將 1mol/L 的 K2HPO4

溶液 132ml 與 1mol/L 的 KH2PO4 溶液 868ml 混勻，其 pH 為

6.0，如需調節 pH，則使用磷酸和氫氧化鉀調節 pH。

10*YNB:34g 酵母 基礎氮源培養基（無硫酸銨）+100g 硫酸銨，溶于 1000ml 水中，過濾除菌。

500*B （0.02%生物素 Biotin） 4℃保存 保存期為 1 年。20mg 的生物素 溶于 100ml 水中，過濾除菌。

100*H （0.4%Histidine 組氨酸） 4℃保存 保存期為 1 年。400mg

的 L-組氨酸溶于 100ml 水中， （加熱至 50℃以促進溶解） ，過濾除菌。

10*D （20%Dextro 葡萄糖） 保存期為 1 年。200g 葡萄糖溶于

1000ml 水中，滅 菌 15min 或過濾除菌。

10*M （5%Methanol 甲醇） 保存期為 2 個月。將 5ml 的甲醇與 95ml 水混勻，過濾除菌。

10*GY （10%Glycerol 甘油） 保存期為 1 年以上。將 100ml 甘油和 900ml 水混勻 后，高壓滅菌或過濾除菌。

100*AA 過濾除菌。 （0.5% of each Amino Acid，各種氨基酸） 4℃保存 保存期為1 年。分 別將 500mg 的 L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-賴氨酸、L-亮氨酸和 L-異亮氨酸溶于 100ml 水中過濾除菌。

1M磷酸鉀溶液（potassium phosphate buffer，pH6.0） ，將 1mol/L

的 K2HPO4 溶液 132ml 與 1mol/L 的 KH2PO4 溶液 868ml 混勻，其 pH 為 6.0，如需調節 pH，則使用磷酸和氫氧化鉀調節pH。

畢赤酵母表達常用載體： 典型的巴斯德畢赤酵母表達載體載體包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的啟動子 和轉錄終止子（5'AOX1 和

3'AOX1） ，它們被多克隆位點（MCS）分開，外源基 因可以在此插入。此載體還包含組氨醇脫氫酶基因（HIS4）選擇標記及 3'AOX1

區。當整合型載體轉化受體時，它的 5'AOX1 和 3'AOX1 能與染色體上的同源基因重組，從而使整個載體連同外源基因插入到受體染色體上， 外源基因在 5'AOX1 啟動子控制下表達。畢赤酵母本身不分泌內源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引導分泌的信號序列。而由

89 個氨基酸組成的釀酒酵母的分泌信號—α 交配因 子(α-factor)引導序列已經成功地引導了幾種外源蛋白的分泌。 分泌表達載體主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P 等。胞內表達載體主要 有 ： pHIL-D2 ， pA0815 ， pPIC3K ， pPICZ ，

pHWO10 ， pGAPZ ， pGAPZa(Invitrogen)， pPIC3.5K 等。工程菌株 Y11430，MG1003，GS115 （AOX1） KM71， ， SMD1168。

畢赤酵母宿主菌常用的有 GS115 和 KM71 兩種， 都具有 HIS4

營養缺陷標記。其中，GS115 茵株具有 AOX1 基因，是 Mut＋，即 表型為 Muts， 甲醇利用正常型； KM71 菌株的 AOX1 位點彼

ARG4 基因插入， 而 即甲醇利用緩慢型，兩種菌株都適用于一般的酵母轉化方法。多拷貝表達菌株的 獲得方式： 與自主復制的質粒型表達載體不同，整合型表達載體的拷貝數可以 有很大的變化。含多拷貝外源基因的表達菌株合成蛋白的量也較多。體內整合可 通過高遺傳霉素抗性，篩選可能的多拷貝插入；而體外整合可通過連接產生外源 基因的串聯插入。多拷貝表達菌株的獲得方式有兩種：一種是利用 SDS-PAGE 電泳、免疫雜交或菌落點雜交方法在大量的轉化子中進行自然篩選。得到產量高 的表達菌株。另一種在轉化前將多個表達盒拷貝插入到單個載體中，而后再通過交換整合到受體染色體上。表達蛋白純化方法： 酵母系統表達的蛋白一般都具 有活性，所以都采用較溫和的純化方式來純化目的蛋白，分泌型表達的蛋白有利

于純化，可用硫酸銨沉淀，然后用離子交換，凝膠過濾層析，疏水層析等方法進 一步純化。具體的方法和操作應按所處理的目的蛋白的性質選擇。

2.畢赤酵母利用的優缺點分析

is酵母菌體內無天然質粒，所以表達載體需與宿主染色體發生同源重組，將外源基因表達框架整合于染色體中以實現外源基因的表達。包括啟動子、外源基因克隆位點、終止序列、篩選標記等。表達載體都是穿梭質粒，先在大腸桿菌復制擴增，然后被導入宿主酵母細胞。為使產物分泌胞外，表達載體還需帶有信號肽序列。

甲醇營養型畢赤酵母優點： (1)具有醇氧化酶AOX1基因啟動子，這是目前最強，調控機理最嚴格的啟動子之一； (2)表達效率高,其表達的外源蛋白可占總表達蛋白的90%以上,有利于目的蛋白的分離純化；(3)在簡單合成培養基中可實現高密度培養；

(4)表達質粒能在基因組的特定位點以單拷貝或多拷貝的形式穩定整合；

(5)由于該酵母可以以甲醇為唯一的碳源和能源,而絕大多數微生物并不能以甲醇為碳源,可以減少污染。甲醇營養型畢赤酵不足之處：

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