生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)論文——人血清白蛋白的研究與生產(chǎn)

2023年12月4日發(fā)(作者：怎么寫對聯(lián))

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報(bào)告題目： 人血清白蛋白的研究與生產(chǎn)

一、人血清白蛋白國內(nèi)外研究現(xiàn)狀

1、人血清白蛋白的簡要介紹

人血清白蛋白( human rum albumin，HSA) 是由585個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈無糖基蛋白質(zhì)，具有結(jié)合、運(yùn)輸內(nèi)源性與外源性物質(zhì)和維持血漿pH、膠體滲透壓穩(wěn)定等生理活性。HSA主要是由18種氨基酸殘基組成，N末端為天冬氨酸，C末端為亮氨酸。整個(gè)蛋白質(zhì)分子共含有17個(gè)二硫鍵，Cys34上有唯一游離的巰基，在蛋白質(zhì)修飾中有重要應(yīng)用。HSA在血漿中最為豐富，是迄今為止產(chǎn)量最大、用量最大的蛋白質(zhì)藥物。在人體內(nèi),血清白蛋白具有維持血液滲透壓和攜帶血液中多種配基(包括脂肪酸、氨基酸、類固醇、金屬離子及藥物)與組織進(jìn)行交換等生理功能,臨床用于手術(shù)輸血和危重病人補(bǔ)液,治療創(chuàng)傷休克、發(fā)燒、水腫、低白蛋白血癥和紅細(xì)胞過多癥等,而且能增強(qiáng)人體抵抗能力,是重要的臨床藥物。由于HSA主要通過從血漿中提取而獲得，具有來源有限、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，因此，很多學(xué)者積極探討基因工程、細(xì)胞工程等制備方法。關(guān)于HSA的非治療作用如用作藥劑輔料、診斷試劑、手性物質(zhì)分離劑、培養(yǎng)基添加劑等的報(bào)道也越來越多。

2、HSA的生物功能

2.1運(yùn)輸功能

血液攜帶機(jī)體所需要的氧、蛋白質(zhì)、糖類、脂肪、維生素、水和電解質(zhì)等。血漿蛋白與多種物質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物,便于在血液中的運(yùn)輸。其中白蛋白與脂肪酸結(jié)合,使其成為水溶性;它也可以與一些小分子物質(zhì)(如激素)呈可逆性的結(jié)合,防止它們從腎臟流失,并通過結(jié)合態(tài)和游離態(tài)之間的動(dòng)態(tài)平衡,維持血液中這些物質(zhì)濃度相對穩(wěn)定。

2.2維持內(nèi)環(huán)境相對穩(wěn)定

機(jī)體細(xì)胞必須依靠血液在組織液與各內(nèi)臟器官之間進(jìn)行有效的水分、熱量和物質(zhì)交換,才能通過內(nèi)臟器官的活動(dòng)來維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。正常人血清滲透壓約為5330mmHg。血清蛋白的分子質(zhì)量大,所產(chǎn)生的滲透壓小,不超過25mmHg,稱為血清膠體滲透壓,它可以維持血管內(nèi)外的水平衡。血清膠體滲透壓主要來自白蛋白。若白蛋白明顯減少,血清膠體滲透壓也將明顯減少。血清pH值主要決定于血

清中的白蛋白和它的鈉鹽組成的緩沖對,所以人血清白蛋白及其它無機(jī)鹽緩沖對協(xié)同緩沖了血清的酸堿變化。

2.3其它功能

最近,有報(bào)道人血清白蛋白與CD4受體的融合蛋白(HSA-CD4)可作為人免疫缺陷病毒(HIV)的感染阻斷劑。該工藝?yán)昧巳搜灏椎鞍自谌梭w內(nèi)分布廣,半衰期較長且沒有酶學(xué)或免疫學(xué)活性,作為生物活性載體可以克服CD4蛋白在人體內(nèi)半衰期極短的缺點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)證明重組可溶性CD4能有效阻止HIV感染CD4+淋巴細(xì)胞,有望成為一種愛滋病毒的拮抗藥物。

3、人血清白蛋白的研究與開發(fā) 當(dāng)前市場上所用的 HSA 制品大多通過從人源血漿中分級過濾提取。2010 年版《中國藥典》所收載的 HSA 的制備方法是通過從健康人血漿中提取，經(jīng)低溫乙醇法或經(jīng)批準(zhǔn)的其他分離法分離純化并經(jīng)60℃10 h加溫滅活病毒后制成。成品的純度應(yīng)不低于蛋白質(zhì)總量的96. 0%。此方法依據(jù)的原理主要是蛋白質(zhì)在不同 pH 值和不同離子強(qiáng)度條件下溶解度不同。

由于血漿容易受到病毒等微生物污染及來源有限等原因，一些學(xué)者開始通過基因工程來獲得重組人血清白蛋白( recombinant human

rum albumin，rHSA) 。1981年，首次報(bào)道HSA 基因在大腸桿菌中成功表達(dá)，表達(dá)出的蛋白質(zhì)為白蛋白的前體，在細(xì)胞內(nèi)形成包涵體，但大量生產(chǎn)難以實(shí)現(xiàn)。為此，科學(xué)家們研究了以枯草芽孢桿菌作為宿主菌表達(dá)rHSA，這一系統(tǒng)表達(dá)的 rHSA 難以穿過細(xì)胞壁，信號肽的切除率隨表達(dá)量增加而減少，因而也難以作為大規(guī)模生產(chǎn)的工程菌。酵母作為真核生物，能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行翻譯后修飾，有利于蛋白質(zhì)的正確折疊。研究者利用釀酒酵母、克魯維氏酵母、畢赤酵母、漢遜酵母等作為宿主菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以畢赤酵母為表達(dá)系統(tǒng)可高表達(dá)rHSA。除此以外，還有利用蠶、馬鈴薯、豬等作為表達(dá)系統(tǒng)的，但是分泌的rHSA過少或同源性不好。目前，已經(jīng)工業(yè)化生產(chǎn)rHSA的公司有日本的三菱公司、英國的 Novozymes公司美國的Genetech公司等。在國內(nèi)，第一個(gè)獲得 rHSA 生產(chǎn)方法國家發(fā)明專利的是中山海濟(jì)醫(yī)藥生物工程有限公司，HSA表達(dá)量為3. 5 g/L左右。華北制藥有限公司的“發(fā)酵生產(chǎn)重組人血清白蛋白的方法”在之后也獲得了國家發(fā)明專利，正在進(jìn)一步開發(fā)。武漢大學(xué)楊代常教授利用水稻胚乳細(xì)胞作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)rHSA，每 1

kg 種子的 rHSA 量可達(dá)3 g以上。由于HSA 是由肝細(xì)胞分泌的，還有人研究了利用肝細(xì)胞培養(yǎng)獲得HSA，這也是繼分級提取和基因工程以外的第三種獲取HSA的方法，但能否在將來獲得工業(yè)生產(chǎn)的應(yīng)用還需進(jìn)一步研究。

值得一提的是，由武漢大學(xué)生命科學(xué)院和武漢禾元生物科技有限公司組成的研發(fā)團(tuán)隊(duì)從2006年開始進(jìn)行植物源替代血漿來源的醫(yī)藥蛋白的研究與開發(fā)，現(xiàn)已取得突破性進(jìn)展并已跨入規(guī)模化生產(chǎn)的階段，填補(bǔ)了國際上此項(xiàng)技術(shù)空白。相關(guān)論文于2011年10月31日在線發(fā)表于《美國科學(xué)院院報(bào)》（PNAS）。該研究表明由轉(zhuǎn)基因水稻種子生產(chǎn)的重組人血清白蛋白(OsrHSA)在生理生化性質(zhì)、物理結(jié)構(gòu)，生物學(xué)功能、免疫原性與血漿來源的人血清白蛋白一致；并建立了大規(guī)模生產(chǎn)重組人血清白蛋白的生產(chǎn)工藝，獲得了高純度和高產(chǎn)量重組人血清白蛋白產(chǎn)品。利用大量數(shù)據(jù)證明了轉(zhuǎn)基因水稻種子可取代現(xiàn)有基于發(fā)酵的表達(dá)技術(shù)來生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)是經(jīng)濟(jì)有效的。正如PNAS審稿人對該文章的評價(jià)：“這篇文章解決了在科學(xué)上振奮人心、在經(jīng)濟(jì)上都非常重要的議題－－即用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)血漿產(chǎn)品或其他蛋白產(chǎn)品的技術(shù)平臺(tái)，可代替其他基于發(fā)酵的表達(dá)技術(shù)，其重要性也不言而喻??這篇文章近乎完美地證實(shí)了植物生產(chǎn)的醫(yī)藥蛋白和批準(zhǔn)臨床使用的血漿來源醫(yī)藥蛋白是完全相同的，并提供了翔實(shí)數(shù)據(jù)證明植物系統(tǒng)規(guī)模化容易和成本優(yōu)勢?！? 二、研發(fā)的思路

1、整體思路

本文用巴斯德畢赤酵母（Pichia Pastoris）構(gòu)建并篩選分泌重組人血清白蛋白(rHSA)基因工程高產(chǎn)菌株，并對其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行純化。

在構(gòu)建高產(chǎn)人血清白蛋白的基因工程菌時(shí)，采用分泌型表達(dá)質(zhì)粒

pPIC9K構(gòu)建成質(zhì)粒pPIC9K-hsa。構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)線性化后電轉(zhuǎn)化整合進(jìn)入畢赤酵母GS115染色體AOX1基因中，通過MD/MM平板篩選出his+Muts型菌株。在此基礎(chǔ)上，用G418平板篩選出高拷貝表達(dá)子。BMGY/BMMY 搖瓶培養(yǎng)對不同的拷貝子進(jìn)行篩選，用免疫印跡檢測所表達(dá)的 rHSA 是否具有免疫原性。采用工業(yè)基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基，在搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。

rHSA 的純化路線為：離心后上清液經(jīng)60℃處理8h對蛋白酶滅活，冷至常溫時(shí)離心除去熱處理的變性蛋白；再經(jīng)透析袋脫鹽交換緩沖液，使得其條件為0.005mol/L，pH6.4的磷酸鈉緩沖液；再將其上平衡后的DEAE Sephro FF陰離子交換柱然后以0.010mol/L，pH8.0的磷酸鈉緩沖液加以0.10 mol/L，0.20mol/LNaCl濃度進(jìn)行梯度洗脫。

2、研發(fā)流程：

基因重組途徑：選擇人血清白蛋白基因→選擇合適的表達(dá)體系→構(gòu)建重組表達(dá)載體→轉(zhuǎn)入高效表達(dá)載體中表達(dá)→發(fā)酵→粗提→純化→加工→成品 3、巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的一般步驟

巴斯德畢赤酵母自80年代初被開發(fā)為外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)以來一直被廣泛應(yīng)用，一些重組蛋白已成為正式產(chǎn)品進(jìn)入了市場。至今已有

300多種外源蛋白在該表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)，已報(bào)道的最高表達(dá)量分別為22g/L(胞內(nèi))和14.8g/L(分泌)。在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)蛋白的步驟比大腸桿菌要復(fù)雜得多。一般的步驟為：

(1)目的基因的克隆 選用合適的內(nèi)切酶把外源基因克隆于表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)，如果選用的是分泌型表達(dá)載體，則外源基因的閱讀框架和信號肽的閱讀框架應(yīng)該保持一致。

(2)重組載體線性化 重組載體只有被線性化，整合效率才能大大提高，環(huán)狀質(zhì)粒整合效率是很低的。

(3)轉(zhuǎn)化 一般選用原生質(zhì)球法或電擊法。

(4)篩選 可先利用載體和營養(yǎng)缺陷型菌株的互補(bǔ)性或?qū)股氐目剐詠磉M(jìn)行初篩，復(fù)篩可用多聚鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。對于大量轉(zhuǎn)化子的篩選，可用原位點(diǎn)雜交法進(jìn)行。用原位點(diǎn)雜交不僅可以篩選大量轉(zhuǎn)化子，還可以鑒定多拷貝。

(5)外源蛋白的表達(dá) 如果表達(dá)載體的啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子，則表達(dá)比較簡單；如果載體的啟動(dòng)子是醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，則外源蛋白的表達(dá)分為2步，即菌體生長和蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。

(6)放大 表達(dá)的條件(如通氣狀況，pH 值，培養(yǎng)基的組成等)，經(jīng)優(yōu)化以后就可以按比例放大，從搖瓶培養(yǎng)轉(zhuǎn)至大規(guī)模發(fā)酵。

三、技術(shù)路線 1、巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)

巴斯德畢赤酵母表達(dá)體系是近十年發(fā)展起來的真核表達(dá)體系。作為一種成功的表達(dá)體系，有好幾種因素促進(jìn)了它的快速推廣。主要包括如下幾方面：(1)利用受甲醇誘導(dǎo)的醇氧化酶(alcohol oxida I，AOX1)啟動(dòng)子，可嚴(yán)格控制外源基因的表達(dá)。(2)畢赤酵母屬于單細(xì)胞微生物，保留了細(xì)菌的特點(diǎn)，營養(yǎng)要求簡單，生長快速，適合高密度培養(yǎng)，發(fā)酵后每升培養(yǎng)液中細(xì)胞干重可達(dá)100克以上，有利于提高目的蛋白產(chǎn)量；發(fā)酵技術(shù)也比較成熟，具有大規(guī)模生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品的潛力。(3)酵母是低等真核生物，很少產(chǎn)生有毒物質(zhì)，毒性比細(xì)菌小。(4)畢赤酵母作為一種真核細(xì)胞生物，具有真核生物的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可進(jìn)行很多典型的高等真核生物的蛋白翻譯后加工修飾，如糖基化、脂酞化、磷酸化以及蛋白裂解、折疊、二硫鍵的形成等。(5)畢赤酵母分子生物學(xué)操作技術(shù)與釀酒酵母

siae非常相似，而后者的遺傳背景和生理特性研究得比較透徹，是現(xiàn)代生物學(xué)中了解較清楚、應(yīng)用很廣泛的表達(dá)系統(tǒng)之一，因而可為前者提供很多借鑒；另外，畢赤酵母也已有20多年的研究開發(fā)歷史，有多種受體菌和表達(dá)載體可供選擇，可以進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)或分泌表達(dá)。（6）產(chǎn)物易于純化，特別是高分泌性的外源蛋白占所有被分泌蛋白的30%以上，容易分離。

2、表達(dá)載體的整合及其優(yōu)化

（1）宿主菌的表型及載體的整合

重組載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入畢赤酵母受體菌一般整合在染色體上，因而整合十分穩(wěn)定。常見得整合方式有兩種，即單交換型和雙交換型兩種方式。載體整合位點(diǎn)包括AOX1和HIS4，也即涉及到甲醇利用表型（Mut）問題。表達(dá)菌株的甲醇利用表型與表達(dá)盒的染色體整合位點(diǎn)和方式通過一種或兩種AOX基因的刪除插入或替代。根據(jù)利用甲醇的能力，畢赤酵母宿主菌可劃分為3種表型。最廣泛使用

的菌株GS115(HIS4)含有野生型AOX1和AOX2基因，利用甲醇的表型為Mut+。KM71(HIS4，AOX1ΔARG4)菌株的AOX1基因大部分被刪除和取代，它必須依賴表達(dá)很弱的AOX2基因，故利用甲醇表型為Muts。MC-100-3(HIS4，AOX1ΔARG4，AOX2ΔPHIS4)的兩種 AOX 基因均被刪除，表型為Mut-。這3種宿主菌都保留了利用來自載體的AOX1啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)外源基因的能力。在畢赤酵母中一般通過同源重組穩(wěn)定整合于染色體的AOX1區(qū)或 HIS4

區(qū)。整合方式上，AOX1 區(qū)的整合包括同源雙交換引起的基因置換和位點(diǎn)特異性單交換引起的基因插入。前者使染色體 AOX1 基因被外源基因表達(dá)盒替換，Mut+表型菌株會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)镸uts或Mut-，而 Muts和 Mut-菌株表型不變；后者即單交換引起基因插入不改變宿主原有的AOX1基因，故各種菌株的Mut表型不變。HIS4區(qū)的整合方式為位點(diǎn)特異性單交換。表達(dá)載體向 HIS4區(qū)或 AOX1區(qū)的整合賦予宿主菌野生型組氨醇脫氫酶基因，使其表型由 HIS-變?yōu)镠IS+，可以此篩選轉(zhuǎn)化子。Mut+菌株已經(jīng)成功地表達(dá)了很多蛋白(如表皮生長因子、胰島素樣生長因子等)。Muts菌株雖然在誘導(dǎo)階段生長緩慢，但有時(shí)外源蛋白的表達(dá)反而更高，更有利于蛋白的正確折疊。如PepT1的表達(dá)在 Muts菌株中較高。應(yīng)該說，Mut+和Muts表型的菌株各有優(yōu)缺點(diǎn)，關(guān)鍵由外源蛋白而定。總之，很難預(yù)見某種外源蛋白在哪種Mut表型的菌株中表達(dá)水平更高，故建議考察各種Mut表型菌株中的表達(dá)情況，經(jīng)驗(yàn)性地選擇適于特定外源蛋白表達(dá)的株型。原則上，對于胞內(nèi)表達(dá)應(yīng)盡量選用非Mut+菌株，使蛋白產(chǎn)物中AOX蛋白量較少，而目的蛋白相對較多，這樣更有利于簡化下游的純化。胞外表達(dá)采用Muts菌株，但這些菌株利用甲醇能力低，生長緩慢，可添加其它碳源(如甘油、山梨醇、丙氨酸等)來加快細(xì)胞的生長和代謝，提高目的蛋白產(chǎn)率。

雖然AOX2和AOX1基因的序列同源性高達(dá)92%，但AOX2基因表達(dá)產(chǎn)物在正常細(xì)胞中僅占總酶量的5%。這樣就使細(xì)胞利用甲醇的能力大大下降，從而使表達(dá)量下降且延長了細(xì)胞發(fā)酵時(shí)間(150～200h)。為了克服這一缺點(diǎn)，研究者通過分離選擇恢復(fù)利用甲醇能力的自發(fā)突變體，從AOX1基因缺陷菌株中分離得到Mut+

的自發(fā)突變體。他們對突變體的AOX2基因上游區(qū)域經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序，確定了該突變體在-255和-259兩個(gè)位置的堿基發(fā)生了改變，而這兩個(gè)位置為阻遏蛋白結(jié)合區(qū)域。該區(qū)域發(fā)生點(diǎn)突變后阻遏蛋白便不能很好地與之結(jié)合，通過去阻遏作用使得轉(zhuǎn)錄效率增強(qiáng)，從而提高表達(dá)量和縮短發(fā)酵時(shí)間。

（2）多拷貝整合及篩選

獲得多拷貝重組子的方法主要有：(a)在體外利用同尾酶向載體中多次插入首尾相連的表達(dá)盒。此法的優(yōu)點(diǎn)是一次整合，即可有多個(gè)表達(dá)盒插入染色體。但體外基因操作較繁瑣。(b)根據(jù)G418抗性水平與kanr拷貝數(shù)的正相關(guān)性，篩選到高拷貝重組子。(c)利用含細(xì)菌Sh ble基因的表達(dá)載體，根據(jù)Zeocin抗性水平與ble基因拷貝數(shù)的正相關(guān)性，篩選到高拷貝重組子。ble基因很小(375bp)，可兼作 E.

coli和P. pastoris的篩選標(biāo)志，故載體很小(僅3Kb)，易操作。但

Zeocin是一種誘變劑，有引起轉(zhuǎn)化子突變的可能。利用抗藥性水平獲得高拷貝重組子的方法簡單快速。但相當(dāng)大的一部分高抗性轉(zhuǎn)化子不含多拷貝基因。故在（b）、（c）方法的基礎(chǔ)上，需進(jìn)一步篩選確定真正的高拷貝高表達(dá)重組子。(d)利用 DNA分析方法檢測外源

DNA含量，此法更為直接快捷，但應(yīng)輔以前述方法以降低工作量，提高篩選效率。(e)選擇單交換整合方式以有利于形成多拷貝重組子。位點(diǎn)特異性單交換引起的多拷貝基因插入比在兩個(gè)獨(dú)立單位點(diǎn)發(fā)生雙交換產(chǎn)生多拷貝基因的概率高，大約為1%～10%。(f) 使用原生質(zhì)法、電激法以提高形成高拷貝轉(zhuǎn)化子的頻率。巴斯德畢赤酵母的轉(zhuǎn)化方法有原生質(zhì)法、電激法、氯化鋰法等，其中以原生質(zhì)法轉(zhuǎn)化使細(xì)胞群中產(chǎn)生的多拷貝轉(zhuǎn)化子頻率相對較高，但若使用

G418檢測拷貝數(shù)，則配合電激法轉(zhuǎn)化的效果較好。

由于高拷貝并非意味著高表達(dá)，即基因拷貝數(shù)與表達(dá)水平的關(guān)系取決于特定的外源蛋白。所以在獲得多拷貝重組子的基礎(chǔ)上，要進(jìn)一步篩選確定因具有合適拷貝數(shù)而顯示最佳蛋白表達(dá)水平的菌株，亦即高表達(dá)菌株的篩選應(yīng)以表達(dá)的蛋白量為最終標(biāo)準(zhǔn)。傳統(tǒng)的方法是利用 SDS-PAGE 電泳直接分析蛋白表達(dá)檢測高表達(dá)轉(zhuǎn)化子。最近出現(xiàn)的方法有菌落免疫印跡和活性分析等方法檢測到高表達(dá)轉(zhuǎn)化子。菌落免疫印跡的過程為：首先將菌落轉(zhuǎn)至醋酸纖維素膜上，再與硝酸纖維素膜疊放在酵母固體培養(yǎng)基上，經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng)后分泌蛋白就印在硝酸纖維素膜上，接著用此蛋白的抗體檢測，即可挑出最高蛋白量對應(yīng)的克隆。用這種方法，每套濾膜可篩選出

100~1000個(gè)克隆，從而快速地從大量重組子中篩選出高表達(dá)克隆。

3、培養(yǎng)條件

培養(yǎng)條件主要包括培養(yǎng)基、通氣量、pH、甲醇含量和培養(yǎng)時(shí)間等。P. pastoris常見培養(yǎng)基的配制及使用見Invitrogen公司的P.

pastoris express kit。另外，由于表達(dá)不同的蛋白和提高表達(dá)蛋白的產(chǎn)量及活性，還常使用其它不同的培養(yǎng)基。如防止人血清白蛋白降解的 PBM 及 PFM 培養(yǎng)基，用于高密度培養(yǎng)的補(bǔ)料培養(yǎng)基FM21等。

充足的通氣量對于誘導(dǎo)階段外源蛋白的表達(dá)極其重要。充足的氧氣是巴斯德畢赤酵母高效表達(dá)所必需的，一般要求溶氧（DO）最好處在 30%~60%之間。當(dāng)DO 過低時(shí)，P. pastoris 便會(huì)產(chǎn)生乙醇或乙酸，抑制外源蛋白的表達(dá)。然而隨著生物量的增加，轉(zhuǎn)速和通氣量增加到一定的限度時(shí)便需要摻入氧氣甚至完全通入氧氣以維持所需的DO值。另外，利用機(jī)械裝置微沫發(fā)生器可以使通入的空氣或氧氣生成很小的微沫。從而有效的增加 DO 值和氧氣對酵母細(xì)胞的傳質(zhì)系數(shù)。利用該裝置的結(jié)果可以使攪拌轉(zhuǎn)速降低約一倍左右，因而對大型發(fā)酵設(shè)備來講有更好的應(yīng)用價(jià)值。在搖瓶培養(yǎng)時(shí)，為了增加溶氧，發(fā)展了一種SCM搖瓶技術(shù)，這種搖瓶技術(shù)培養(yǎng)條件比普通搖瓶發(fā)酵更接近于發(fā)酵罐發(fā)酵，可以使外源蛋白的表達(dá)比普通搖瓶發(fā)酵提高2.6~10倍。這對于重組轉(zhuǎn)化子的篩選具有較強(qiáng)的指導(dǎo)意義，因?yàn)椴煌霓D(zhuǎn)化子在搖瓶和發(fā)酵罐發(fā)酵時(shí)可能不同。

P. pastoris 適宜生長的pH為3.0~7.0，根據(jù)需要可以選擇不同的pH

值。一般誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)pH為6.0，生長期pH為5.0。有時(shí)為了在生長初期防止染菌，一般采取較低的pH進(jìn)行發(fā)酵。另外，為了防止表達(dá)蛋白的降解，可以降低或者升高培養(yǎng)時(shí)的pH。對于培養(yǎng)時(shí)甲醇的含量，不同的表型甲醇的利用速率不同，一般的經(jīng)驗(yàn)是甲醇含量不超過5g/L時(shí)不會(huì)對畢赤酵母細(xì)胞造成毒害。在誘導(dǎo)時(shí)，一般都要經(jīng)過一個(gè)甲醇利用適應(yīng)期，隨后進(jìn)入甲醇快速的穩(wěn)定期。對甲醇流加量的控制最好是通過在線檢測來實(shí)現(xiàn)。另外對于不同的蛋白，也可離線檢測甲醇含量建立甲醇利用模型來指導(dǎo)甲醇流加，有時(shí)還可以根據(jù)溶氧的變化來改變甲醇的流加量，但這不能做到完全精確，容易造成甲醇過量。

巴斯德畢赤酵母的發(fā)酵周期一般長達(dá)140~200h。一般的成批培養(yǎng)可分為四個(gè)階段，即初期培養(yǎng)階段，增加生物量的甘油流加或與基礎(chǔ)鹽共同流加階段，甲醇誘導(dǎo)階段，甲醇和其它碳源如甘油山梨醇等的共同誘導(dǎo)階段。其中，甘油流加或與基礎(chǔ)鹽混合流加可使生物量大大增加，但生物量越大，培養(yǎng)基中的氧和營養(yǎng)供給就越受限制，因而不一定有利于外源蛋白的表達(dá)，如發(fā)生蛋白質(zhì)的過量水解等問題，所以是否需要高生物量有賴于所要表達(dá)的外源蛋白的性質(zhì)(如溶解度、穩(wěn)定性、毒性等)。另外，甲醇和甘油等碳源混合流加可使有些表達(dá)菌株代謝更活躍，合成蛋白更迅速。

4、提高產(chǎn)物穩(wěn)定性

提高目的蛋白穩(wěn)定性，使之免受蛋白酶降解的常用的 5 種策略如下：一是在培養(yǎng)基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物等，增加蛋白酶的底物以減少目的蛋白降解。二是因 P. pastoris

可在較寬的 pH 范圍內(nèi)生存，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基 PH 值抑制蛋白酶活性。三是降低甲醇誘導(dǎo)時(shí)的培養(yǎng)溫度。四是發(fā)酵時(shí)控制一定的比生長速率或利用連續(xù)培養(yǎng)的發(fā)酵方式。五是使用蛋白酶缺陷菌株，如

SMD1163、SMD116和SMD1168。但這些菌株活性差，生長慢

且難轉(zhuǎn)化，所以只有在其他方法不能奏效時(shí)才推薦使用。此外，可通過共表達(dá)蛋白酶抑制物來抑制蛋白酶活性，減少目的蛋白降解；可將目的蛋白與一種在 is 中穩(wěn)定的蛋白伴侶融合表達(dá)，通過改變目的蛋白的性質(zhì)來提高穩(wěn)定性；也可嘗試將目的蛋白連上一個(gè)過氧化物酶體靶向信號(peroxisomal targetingsignal，PTS)，使其被分揀轉(zhuǎn)運(yùn)入過氧化物酶體貯存起來，免受蛋白酶降解，還可減少對宿主細(xì)胞的毒害作用。

5、人血清白蛋白的分離純化

實(shí)現(xiàn)醫(yī)藥級 rHSA 的工業(yè)化生產(chǎn)對重組蛋白的分離純化技術(shù)是個(gè)極具挑戰(zhàn)性的課題。因?yàn)椋?1)產(chǎn)品對純度要求極高。99.999%的純度對于一般的重組蛋白來說已經(jīng)足夠，但由于白蛋白藥業(yè)的劑量較大，因而任何痕量的雜蛋白均可能造成嚴(yán)重的免疫反應(yīng)。目前日本 Green Cross 公司的產(chǎn)品達(dá)到 99.999999%的純度。(2)血源HSA單位價(jià)格相對其它血蛋白較低，市場售價(jià)約40元/克。因而只有在高

表達(dá)的基礎(chǔ)上降低rHSA的單位分離成本，才能取代傳統(tǒng)的提取方法。因此rHSA的分離純化是目前工業(yè)化生產(chǎn)中的關(guān)鍵問題。

5.1重組 rHSA 分離體系特點(diǎn)

rHSA 分離要求高，對發(fā)酵液來講，以下幾個(gè)方面又增加了 rHSA

分離純化的難度：（1）含量少。目的產(chǎn)物在起始培養(yǎng)基中含量較低，一般在 3g/L 左右。（2）組成復(fù)雜。除目標(biāo)產(chǎn)物外，還含有細(xì)胞代謝產(chǎn)物、殘留培養(yǎng)基成分、無機(jī)鹽成分，菌體細(xì)胞組分及其分泌物，如蛋白酶、雜蛋白、核酸、脂肪酸、色素、多糖及熱原物質(zhì)等。（3）產(chǎn)物穩(wěn)定性差。血清白蛋白在蛋白酶作用下極易降解。

5.2 rHSA 分離方法的進(jìn)展及現(xiàn)狀

傳統(tǒng)的從血漿中分離人血清白蛋白的主要以沉淀法為主，如 Cohn

的乙醇沉淀法仍然應(yīng)用于人血清白蛋白的分離純化中。后來又出現(xiàn)了色譜分離法。乙醇沉淀法的優(yōu)點(diǎn)是過程簡單，殺菌和去病毒，缺點(diǎn)是產(chǎn)生非特異性沉淀，使蛋白質(zhì)產(chǎn)生聚集和變性。色譜法的生產(chǎn)的 HSA 的優(yōu)點(diǎn)是純度、產(chǎn)量、單體含量均高于冷乙醇沉淀法，生產(chǎn)條件溫和，生產(chǎn)周期較短，可以進(jìn)行封閉式生產(chǎn)并能實(shí)現(xiàn)流程自動(dòng)化。但單純采用色譜法難以有效地抑制或除去熱原，HIV 等病毒，產(chǎn)品的安全性為人們所擔(dān)憂。近期發(fā)展的色譜與冷乙醇沉淀相結(jié)合的方法，使二者優(yōu)勢互補(bǔ)，應(yīng)用于 HSA 生產(chǎn)后效果顯著，其中澳大利亞 CSL 公司就是成功的例子。rHSA 的分離純化是建立在傳統(tǒng)分離的方法的基礎(chǔ)上的，應(yīng)用新發(fā)展的分離技術(shù)及設(shè)備得到符合藥用要求的產(chǎn)品?？偟乃悸肥窍却址蛛x，以除去最主要的雜

質(zhì)并縮小處理體積；后細(xì)分離，除去特異性的雜質(zhì)，得到合格的產(chǎn)品。常用的方法有沉淀、超濾、吸附、熱處理、層析等。表一是 rHSA

的分離方法之一。典型的純化方法及目的如表二所示

表一、rHSA 純化典型范例

表二、rHSA 分離純化方法之一 還可以用STREAMLINE純化方法：發(fā)酵液于68℃熱處理滅活蛋白酶后進(jìn)行陽離子擴(kuò)張床吸附得到較純的rHSA，再60℃熱處理，脫色，Phenyl cellulorine疏水層析除雜蛋白，再經(jīng)螯合樹脂吸附、陰離子交換、超濾后即得到純r(jià)HSA。應(yīng)用STREAMLINE擴(kuò)張床陽離子吸附的優(yōu)點(diǎn)是一步分離雜質(zhì)，直接獲得目標(biāo)產(chǎn)物，酵母細(xì)胞及其它雜質(zhì)直接通過。該方法將固液分離、吸附、濃縮集成耦合在一起，不但大大簡化了操作步驟，將生產(chǎn)周期從原來的7天縮短為4天；而且使收率提高約60%；另外，STREAMLINE還可與發(fā)酵罐直接相連，在封閉的情況下去除重組微生物，避免微生物的污染。

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附錄

試驗(yàn)操作及方法

1、質(zhì)粒的提取及擴(kuò)增

1.1質(zhì)粒的提取

·將含有質(zhì)粒 pPIC9K-hsa 的菌種接種在 10ml 含氨芐青霉素（AMP，濃度

100μg/ml）的 2×YT 培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)；

·將發(fā)酵液倒入離心管中，5000rpm×10min 離心收集菌體。倒出培養(yǎng)液，盡可能清除殘余液體；

·將細(xì)菌沉淀重懸于 100μl 用冰預(yù)冷的溶液Ⅰ中，加入 5μl 溶菌酶溶液（4mg/ml）劇烈震蕩，使細(xì)菌沉淀完全分散（溶菌酶也可省略）；溶液Ⅰ：50mM

葡萄糖，25mM Tris-HCl(PH8.0)，10mM EDTA(PH8.0)

·加入 200μl 新配制的溶液Ⅱ，蓋緊管口，迅速顛倒離心管數(shù)次以混勻內(nèi)容物，將離心管放置于冰上 10min；溶液Ⅱ：0.2 mM NaOH(臨用前用 10M 儲(chǔ)存液稀釋)，1％SDS

·加入 150μl 用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ，蓋緊管口，迅速倒置后溫和地振蕩 10c

以混勻內(nèi)容物，然后將離心管放置于冰上 3~5min；

溶液Ⅲ：向 60ml 乙酸鉀溶液（5M）中加入 11.5ml 冰乙酸和 28.5ml 水

·臺(tái)式離心機(jī)離心 12000rpm×5min，取出上清移至另一離心管中，棄去管底沉淀； ·向上清液中加入等體積的 Tris 飽和酚、氯仿，振蕩混勻。離心 12000rpm×5min，取上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中，棄去界面及下相；

·再加入等體積氯仿/異戊醇混合液（24：1），混勻后離心 12000rpm×5min，取上相；

·加入 2 倍體積冷無水乙醇，輕輕混勻，放入－20℃冰箱沉淀雙鏈 DNA；

·10min 后離心 12000rpm×15min；

·小心吸去上清，將離心管倒置于吸水紙上，使所有液體流出，再將附于管壁的液滴除盡；

·用 1ml70％乙醇洗滌 DNA 沉淀，離心 12000rpm×15min，棄上清；

·室溫下放置 10min 以使乙醇完全揮發(fā)，加入 20μl 1×TE 或無菌雙蒸水溶解DNA，儲(chǔ)存于－20℃冰箱備用。

注意事項(xiàng)：NaOH，Tris 飽和酚與氯仿均為強(qiáng)腐蝕性化學(xué)試劑，切勿沾到皮膚、

衣物上；若有沾染，立即用大量自來水沖洗。

1.2質(zhì)粒的擴(kuò)增

(1) 感受態(tài) JM109 細(xì)胞的制備

·從LB平板上挑取JM109單菌落接種于5ml 2×YT液體培養(yǎng)基中，37℃劇烈振蕩過夜培養(yǎng)；

·取50μl過夜培養(yǎng)基接種至一有2ml 2×YT培養(yǎng)基的試管內(nèi)，37℃振蕩培養(yǎng)；

·2小時(shí)后停止培養(yǎng)，對光旋轉(zhuǎn)，可看到霧狀線。從中取出 50μl 再次接種至另

一 2ml 2×YT 培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)；

·3小時(shí)左右對光旋轉(zhuǎn)，可見試管內(nèi)霧狀線，在無菌條件下，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到一個(gè)無菌的、用冰預(yù)冷的離心管中，在冰上放置10min，使培養(yǎng)液冷卻至0℃；

·離心 7000rpm×5min，回收細(xì)胞，倒出培養(yǎng)液，將離心管倒置 1min 以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡；

·向菌體中加入 0.6ml 預(yù)冷的 50mM CaCl2溶液，打散菌體，充分洗滌，離心7000rpm×5min，棄上清，收集菌體；

·向菌體中加入 0.2ml 預(yù)冷的 CaCl2、甘油溶液（50mM CaCl2，15％甘油），重懸菌體于溶液中，用封口膜封口后放入 4℃冰箱冷藏 12~20 小時(shí)。

(2) 轉(zhuǎn)化

·將 pPIC9K-hsa 加入到感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)幾次以混勻內(nèi)容物，4℃冰箱放置 30min 以上；

·42℃ 熱激 2min，切勿搖動(dòng)離心管，快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1~2min；

·向管中加入 1ml 2×YT 培養(yǎng)基，37℃水浴培養(yǎng) 1 小時(shí)，使細(xì)胞復(fù)蘇；

·離心 7000rpm×5min，無菌條件下棄去大部分上清，保留約 200μl 左右的培養(yǎng)液；

·懸浮細(xì)胞，無菌狀態(tài)下將菌液轉(zhuǎn)移到含有Amp（100μg/ml）的 2×YT 平板上，均勻涂板；

·在超凈臺(tái)上放置大約15min，待液體被吸收后倒置平皿，37℃恒溫培養(yǎng)12~16小時(shí)。

·待平板上菌落長出后，挑取單菌落于含氨芐青霉素（AMP，濃度 100μg/ml）

的 LB 液體培養(yǎng)基中， 37℃過夜培養(yǎng)后收集菌體進(jìn)行質(zhì)粒提取。將提取所得純化質(zhì)粒溶于 20μl 雙蒸水中，取 4μl 用 0.5％瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢驗(yàn)。 注意事項(xiàng)：以上各步操作均需無菌操作。

1.3 pPIC9K-hsa 的線性化

pPIC9K-hsa BglⅡ 10×H buffer ddH2O 合計(jì)

結(jié)晶約5μg 1.5μl 3μl 25.5μl 50μl

1.4 pPIC9K-hsa 質(zhì)粒檢驗(yàn)與純度濃度的測定

質(zhì)粒 pPIC9K-hsa 的大小由 0.5％瓊脂糖電泳檢驗(yàn)，溴化乙錠染色，熒光分析；

質(zhì)粒的序列驗(yàn)證委托測序公司進(jìn)行測序。質(zhì)粒pPIC9K-hsa濃度及純度測定方法為：取pPIC9K-hsa 質(zhì)粒溶液10μl用蒸餾水稀釋到 4ml，UV3000掃描（200~340nm），分別讀取260nm與280nm 的吸收值A(chǔ)260與A280A260/ A280的比值可確定質(zhì)粒純度。

2、重組工程菌 GS115-HSA 的構(gòu)建及篩選

2.1 GS115感受態(tài)制備及電穿孔轉(zhuǎn)化

菌體的準(zhǔn)備：

·挑取酵母單菌落，接種至含有5ml YPD培養(yǎng)基的25ml三角瓶中，30℃、

250~300r/min 培養(yǎng)過夜；

·取100~500μl的培養(yǎng)物接種至含有50ml新鮮培養(yǎng)基的500ml三角搖瓶中，28~30℃、250~300r/min 培養(yǎng)過夜，至 OD600 達(dá)到 1.3~1.5；

·將細(xì)胞培養(yǎng)物于4℃，1500g離心5min，用50ml的冰預(yù)冷的無菌水將菌體沉淀重懸；

·1500 rpm×5min 離心，用25ml的冰預(yù)冷的無菌水將菌體沉淀重懸；

·1500 rpm×5min 離心，用2ml的冰預(yù)冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸；

·1500rpm×5min 離心，用0.1ml 用冰預(yù)冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，其終體積約為0.2ml；提示：可將其分裝為 80μl一份的包裝冷凍起來，但會(huì)影響其轉(zhuǎn)化效率。

電擊轉(zhuǎn)化：

·將1~5μg的線性化DNA溶解在 5~10μl TE 溶液中，與80μl的上述步驟6所得的菌體混勻，轉(zhuǎn)至0.2cm冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中；

·將電轉(zhuǎn)化杯冰浴5min；

·根據(jù)電轉(zhuǎn)化儀提供的資料，參考其他文獻(xiàn)及多次摸索，確定合適的電壓、電流、電容等參數(shù)，按優(yōu)化的參數(shù)，進(jìn)行電擊；

·電擊完畢后，加入1ml冰預(yù)冷的1mol的山梨醇溶液將菌體混勻，轉(zhuǎn)至 1.5ml的EP管中；

·將菌體懸液涂布于MD平板上，每200~600μl涂布一塊平板；

·將平板置于30℃培養(yǎng)，直至單個(gè)菌落出現(xiàn)。

推薦：電壓1.5kV；電容25μF；電阻400?。電擊時(shí)間為4~10mc。

注意事項(xiàng)：以上各步操作均需無菌操作，所用離心管與電轉(zhuǎn)杯都要提前滅菌。

2.2 篩選 his+Muts陽性克隆

·GS115菌株為 his－，在不含組氨酸的培養(yǎng)基上無法生長，因此能在MD平板上長出的克隆即為 his+克隆；

·用滅過菌的牙簽將每個(gè)克隆同時(shí)點(diǎn)種于MM、MD平板的對應(yīng)位置上30℃培養(yǎng) 3~6 天；

·兩平板上菌落均會(huì)有所生長，只有 MM 平板上的菌落大小遠(yuǎn)小于 MD 平板上相應(yīng)菌落的菌株才是 Muts表型；

注意事項(xiàng)：因篩選過程中 MD 和 MM 平板的培養(yǎng)時(shí)間較長，鋪平板時(shí)要略厚一些，以免培養(yǎng)過程中出現(xiàn)培養(yǎng)基脫水縮皺現(xiàn)象。

2.3 G418 篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子

將獲得的 His+Muts轉(zhuǎn)化子分別用牙簽點(diǎn)種于不同濃度的 G418 平板，30℃培養(yǎng) 3~6 天。根據(jù)各克隆耐受不同濃度 G418 的情況，可以選出含有不同拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化子。

3 重組工程菌 GS115-HSA 的誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)

·挑選一經(jīng) MD/MM 篩選的單菌落，置于裝有25ml BMGY培養(yǎng)基的 250ml

搖瓶中，于 28~30°C/250~300 rpm 培養(yǎng)至 OD600 = 2~8 (16~18 h)；

·室溫下1500~3000g 離心 5min，收集菌體，用1/5原培養(yǎng)體積BMMY重懸菌體

· 將步驟 2 所得的菌液置于 25ml的搖瓶中，用8層紗布封口，放置于28~30℃/250~300 rpm 的搖床上繼續(xù)生長；

·每24h 向培養(yǎng)基中添加50×M至甲醇終濃度為0.5%；

·按時(shí)間點(diǎn)分別取菌液樣品，取樣量為0.5ml，置于1.5ml EP 管中，最大轉(zhuǎn)速離心2~3min，收集上清，分析目的蛋白的表達(dá)量和菌液最佳收獲時(shí)間。時(shí)間點(diǎn)一般取：24、48、72、96 和 120h；

·分離樣品的上清液加至終濃度為 1mM 的 PMSF 于-20°C 保存，備用于

SDS-PAGE、Western-Blot 活性實(shí)驗(yàn)檢測與鑒定重組蛋白的表達(dá)。

4 、rHSA 的 SDS-PAGE 分析及免疫印跡檢測

4.1 Tricine-SDS-PAGE 凝膠電泳

Tricine-SDS-PAGE 凝膠電泳進(jìn)行 rHSA 的檢測。

(1) 各種溶液的配制

陽極緩沖液：200mM Tris-HCl，PH8.9

Tris：96.8g

HCl（2M）：185ml

加水至 4 升，調(diào)節(jié) PH 至 8.9

陰極緩沖液：100mM Tris，100mM Tricine，0.1％SDS，PH8.25

Tris： 12.1g

Tricine：17.9g

SDS： 1.0g

加水至 1 升

凝膠緩沖液：3M Tris-HCl，0.3％SDS，PH8.45

Tris： 36.3g

HCl（2M）：50ml

SDS：300mg

加水至 100ml，調(diào)節(jié) PH 至 8.45

母液 1：30％T，3％C

Acrylamide： 28.1g Bisacrylamide：0.9g

加水至 100ml，4℃下保存

固定液：40％methanol，10％acetic acid

methanol： 400ml

acetic acid：100ml

加入 500ml 水搖勻

Coomassie blue 染色液：Coomassie blue 0.025％

Acetic acid： 100ml

Coomassie blue： 0.25g

Deionized water： 900ml

脫色液：acetic acid 10%

Acetic acid： 100ml

Deionized water 900ml

樣品液：

0.5M Tris-HCl(PH6.8)： 2.0ml

Glycerol： 2.4ml

10%SDS： 1.0ml

β-mercaptoethanol： 0.2ml

0.5% Coomassie blue： 0.4ml

Deionized water： 4.0ml

(2) 制膠

·徹底清洗玻璃板（洗滌靈擦洗、自來水沖洗、蒸餾水沖洗、無水乙醇擦洗），

在兩玻璃板間放置涂有少許凡士林的硅化橡膠條，兩邊用夾子夾??；

·在玻璃板外側(cè)用記號筆標(biāo)出灌注 parate gel 溶液所要達(dá)到的刻度；

·首先灌注 parate gel 至刻度 1 處，小心地在上面覆蓋一層水，室溫下凝聚；

parate gel：10％T 3％C

母液 1 凝膠緩沖液 60%甘油 TEMED 1.55％過硫酸銨

1.5ml 1.5ml 1.25ml 5μl 250μl

·凝聚后用小濾紙條吸去表面的水分，插入梳板，配制 stacking gel 溶液，搖勻后灌注在 spacer gel 上面，室溫下靜置 1 小時(shí)；

stacking gel：4％T 3％C

母液 1 凝膠緩沖液 TEMED 1.55％過硫酸銨 去離子水

0.4ml 0.75ml 3μl 150μl 1.70ml

·將凝聚好的膠板小心的拔出頂部梳條，并去掉底部邊條，用濾紙條擦干凈底部的凡士林。

備注：以上各種凝膠的配比適用于 15×10×0.15cm 垂直平板電泳體系。

(3) 電泳

·在凹面玻璃板一側(cè)涂一些凡士林，使玻璃板緊貼于電泳槽，兩邊用夾子夾緊；

·向陽極槽中加入陽極緩沖液，陰極槽中加入陰極緩沖液；

·將待測樣品與樣品液按 1：1 體積比混勻后，用微量注射器加樣至梳孔；

·接通電源，10mA（恒流）30－60min，然后改為 25－35mA（恒流），待指示劑移至凝膠下端時(shí)切斷電源，停止電泳。 (4) 染色

·把垂直平板電泳槽上的玻璃輕輕扳開，將凝膠取下，放入固定液中 30min，固定時(shí)間最長不超過 45min；

·將凝膠放入染色液中，染色約 1 小時(shí)，染色時(shí)間最長不超過 1.5 小時(shí)；

·將凝膠移入脫色液中，每 15min 換一次脫色液，直至背景脫盡為止。

(5) 將凝膠進(jìn)行照相并用 Gelpro3.1 進(jìn)行分析表達(dá)量。

注意事項(xiàng)：Acrylamide 和 Bisacrylamide 具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并容易吸附于皮膚，稱量時(shí)應(yīng)佩戴手套和面罩。室溫高時(shí)，可減少過硫酸銨加入量，以免凝聚過快，界面不平。過硫酸銨會(huì)緩慢分解，隔周新鮮配制或凍存于-20℃冰箱。

4.2 免疫印跡

采用硝酸纖維素膜作為印跡用紙，硼酸鈉-甲醇溶液為印跡緩沖液，

以半干式印跡法進(jìn)行電轉(zhuǎn)移。

各種溶液的配方及材料如下：

印跡緩沖液：50mM 硼酸鈉，20％甲醇（PH9.0）

Na2B4O7·10H2O： 4.767g

Methanol： 200ml

加去離子水定容至 1 升，硼酸調(diào) PH 至 9.0

封閉液：20mM Tris-HCl， 0.5M NaCl （pH8.0）

Tris ： 2.42g

NaCl： 29.25g

脫脂奶粉： 30g

加去離子水定容至 1000ml

清洗液：0.85％生理鹽水，0.05％ Tween-20

NaCl： 8.5g

Tween-20：0.5g

加去離子水定容至 1000ml

·電泳結(jié)束前 30min 準(zhǔn)備好大小相同的濾紙和硝酸纖維素膜（每一邊伸出作為模板的凝膠約 2mm），將硝酸纖維素膜的預(yù)處理。過程為：將膜小心地放在水面上使其浸濕。通過毛細(xì)管作用從底部開始浸濕硝酸纖維素膜，時(shí)間約

4min，然后將膜浸入水中 2min，再浸入緩沖液中備用。裁剪好與膜和膠相同大小的濾紙，將其浸入緩沖液中備用。

·用去離子水清洗印跡槽，石墨電極在印跡過程之前應(yīng)一直保持潮濕狀態(tài)；

·在電泳結(jié)束之前 5min 準(zhǔn)備陽極側(cè)“三明治” ：將四、五層濾紙一層一層卷著放到陽極上，用玻璃棒滾壓濾紙擠出氣泡；

·將膜小心地放好，不要卷曲膜片。在凝膠放上去之前，膜是不能變干的；

·電泳結(jié)束后，將凝膠直接放在膜上面。然后在凝膠上一層一層放上四、五層濾紙。每一層都經(jīng)過滾壓來趕走氣泡；（“三明治”不應(yīng)太濕，在凝膠與膜之間不應(yīng)有液體）

·用吸水紙吸一下濾紙周邊的液體，關(guān)閉印跡槽，在石墨電極槽上面放置 1kg。

重物使其下沉；

·印跡條件：電流強(qiáng)度為 0.8mA/cm2

印跡 1.5 小時(shí)，電壓限制在 100V 以內(nèi)。

·停止印跡，取出印跡膜并放入封閉液中，搖晃封閉 2 小時(shí)； ·取出印跡膜放并入清洗液中，清洗 5min；

·將膜浸入一抗溶液中搖動(dòng)孵育過夜。將兔抗人血清白蛋白以 1：500 的體積比與封閉液混合，即為一抗溶液。

·取出印跡膜放入清洗液中，清洗三次每次 5min 以完全洗去一抗溶液；

將膜浸入二抗溶液中搖動(dòng)孵育 1 小時(shí)。將山羊抗兔 IGg 以 1：500 的體積比與封閉液混合，即為二抗溶液。

·取出印跡膜，浸入清洗液中，清洗三次每次 5min 以完全洗去二抗溶液

·將膜取出并浸入染色底物 NBT/BCIP 溶液中，搖動(dòng)染色 1 小時(shí)。之后取出膜，放入去離子水中中止染色反應(yīng)。將膜掛起晾干或放在幾層濾紙上吸干以保存。

5、基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基發(fā)酵

5.1培養(yǎng)基

基礎(chǔ)鹽BSM培養(yǎng)基 ：CaSO4·2H2O 0.93g/L ，K2SO418.2g/L ，MgSO4·7H2O

14.9g/L，檸檬酸三鈉 1.47g/L，甘油 4％（w/v），（NH4）2SO410.88g/L，PTM11ml/L，Biotin 0.00004 g/L，磷酸鉀緩沖液（pH6.0）0.1mol/L。高壓滅菌。

基礎(chǔ)鹽PBM培養(yǎng)基：甘油 40g/L，H3PO4(85%) 26.7g/L，CaSO4·2H2O 0.6g/L，K2SO49.5 g/L，Mg SO4·7H2O 7.8 g/L，KOH2.6 g/L，PTM11ml/L，Biotin 0.00004

g/L，硫胺 0.00019 g/L，濃氨水調(diào)節(jié) pH 值為所需 pH。高壓滅菌。

微量元素 PTM1配方：CuSO4·5H2O6g/L，KI0.08g/L，MnSO4·H2O3.0g/L，（NH4） 4H2O 0.2g/L ， H3BO 30.02g/L ， CaSO4· 2H2O 0.5g/L ，6Mo7O24·ZnSO4

20g/L ，98％濃H2SO4

5ml/L ， FeSO4·7H2O 65g/L ， CoCl2· 6H2O ，0.5g/L，生物素 0.2g/L。先加入濃硫酸，再加入其它鹽類，過濾滅菌。

5.2發(fā)酵培養(yǎng)

(1) 接種 GS115-rHSA－8 保存種子液 50ul 于 5ml 的 YPD 培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)16~20 小時(shí)，OD600nm值約 4~8 之間，將 5ml 的一級種子液轉(zhuǎn)接到

250ml 含 20ml基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基的帶擋板的搖瓶中。轉(zhuǎn)速 200rpm，溫度 30℃培養(yǎng)。

(2) 培養(yǎng)期間每 4 小時(shí)用 28％濃氨水調(diào)節(jié) pH 值，精密試紙（5.4~7.0）測量使之保持在所需 pH。

(3) 約 48h 時(shí)，檢測甘油含量，一般此時(shí)甘油剛好耗盡。檢測甘油耗盡后，開始加入甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)。以后每 24 小時(shí)或 12 小時(shí)補(bǔ)加甲醇至所需濃度。誘導(dǎo)后每24 小時(shí)取樣 1ml，離心收集上清液保存待檢測。誘導(dǎo) 4 天后停止發(fā)酵，收集上清液待用。

6、rHSA的分離純化

由于發(fā)酵上清液中 rHSA 比較容易降解，所以在發(fā)酵液進(jìn)行純化處理之前必

須對其中的蛋白酶予以滅活。滅活的方法采用熱處理法。即在 60℃下對發(fā)酵

液熱處理 8h。然后冷卻到室溫，4800r×20min 以除去熱處理后變性的蛋白。經(jīng)處理后的發(fā)酵上清液放入－20℃冰箱備用。

6.1 濃縮方法

6.1.1 丙酮沉淀法

(1) 取處理的發(fā)酵上清液 1 體積，緩慢加入 4 倍體積-20℃預(yù)冷的丙酮，邊加邊攪拌，-20℃沉淀 2 小時(shí)；

(2) 輕輕傾去丙酮溶液，收集沉淀，低溫下真空干燥，收集rHSA粗品。

6.1.2 硫酸銨沉淀法

不斷攪拌下向發(fā)酵上清液中緩慢的加入硫酸銨粉末，使其終濃度分別達(dá)到40%，60%，80%，并用NaOH調(diào)節(jié)pH為rHSA的等電點(diǎn)4.9，4℃下靜止沉淀24h 后高速離心并收集沉淀。

6.2 脫鹽方法

(1) 透析脫鹽。將發(fā)酵上清液裝入 10KD 的透析袋中，放入去離子水中或者需要下一步處理的緩沖液中，更換去離子水或緩沖液直到滿意為止。

(2) 凝膠G25脫鹽。將發(fā)酵上清以適當(dāng)體積上樣于經(jīng)緩沖液平衡過的G25柱中，當(dāng)上樣液剛好走到柱面以下時(shí)，迅速加入平衡緩沖液高于 G25 柱面約5cm高度，盡量避免液面擾動(dòng)以防影響分離效果。再將緩沖液以恒定流速通過蠕動(dòng)泵洗柱，流出液經(jīng)過紫外監(jiān)測儀（280nm）連續(xù)測量溶液中蛋白含量，測量信號輸入記錄儀，記錄下流出液中蛋白濃度隨流出時(shí)間的變化。

6.3 離子交換樹脂純化rHSA

根據(jù)陰離子交換樹脂低鹽吸附，高鹽洗脫的性能。再結(jié)合rHSA的等電點(diǎn)4.9以及各種緩沖體系的緩沖范圍。這里選擇磷酸鈉緩沖液作為緩沖體系。將經(jīng)脫鹽并交換緩沖液的上清液以一定的流速通過蠕動(dòng)泵流過陰離子柱，流出液經(jīng)過紫外監(jiān)測儀（280nm）連續(xù)測量溶液中蛋白含量，測量信號輸入記錄儀，記錄下流出液中蛋白濃度隨流出時(shí)間的變化。然后用一定濃度的磷酸鈉緩沖液＋NaCl溶液將蛋白洗脫下來。

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