某科研項目擬采取的研究方法、技術路線、實驗方案及可行性分析

2023年12月4日發(作者：橫湖小學)

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某科研項目擬采取的研究方法、技術路線、實驗方案及可行性分析

1. 技術路線

基因芯片鑒定X、Y在腸癌肝轉移組織中特異性高表達Y基因RNAi慢病毒感染感染X基因RNAi慢病毒Y沉默后SW1116細胞增殖能力顯著降低X基因過表達慢病毒感染X沉默后SW1116細胞增殖被抑制，遷移能力顯著降低感染Y基因過表達慢病毒Y沉默后，過表達X，SW1116細胞增殖有稍許增強X沉默后，過表達Y對SW1116細胞增殖、遷移無顯著影響X-Y軸可能調控大腸癌肝轉移的發生裸鼠移植瘤模型基因芯片篩選X沉默后下游分子變化半乳糖基轉移酶可能是X調節腸癌細胞肝轉移模式的關鍵裸鼠腸癌肝轉移模型qPCR、WB驗證X對半乳糖基轉移酶的調控EMSA/Co-IP實驗驗證X-Y的RNA/蛋白相互作用對X的序列進行分段，分別構建載體，用Co-IP的方法檢測與Y結合的區域對目標序列區域進行分析，設計點突變，驗證XY結合的位點500例腸癌組織和肝轉移組織樣本的收集免疫組化檢測X、Y蛋白表達和定位根據臨床的病理資料/預后和隨訪資料分析X、Y表達對腸癌預后的臨床意義對腸癌細胞體內成瘤能力的影響in vivo驗證X-Y軸in vivo驗證X-Y軸對腸癌細胞肝轉移能力的影響半乳糖基轉移酶抑制劑驗證其在X介導腸癌細胞肝轉移中的作用闡明X-Y在腸癌肝轉移模式中的作用及機制備注：藍色背景填充部分為前期已完成工作。

2. 研究方法

2.1 X、Y在結腸癌發生、發展中的作用和預后相關性

1) 回顧性收集腸癌臨床標本500例，取手術切除的腸癌組織、匹配的肝臟轉移灶手術和穿刺標本，新鮮組織液氮保存標本200例，石蠟塊300例，全部病例均通過臨床、影像學、病理診斷，術前未進行輔助治療，來自某某醫院2008-2013年臨床收治病例，隨訪資料齊全。 2) 免疫組化檢測組織切片中X、Y蛋白的表達及定位，分別設立陰性對照、腫瘤對照、肝轉移對照。

3) SPSS16.0統計軟件對X、Y表達及定位與臨床標本進行病理關聯性分析和預后統計分析，了解X、Y表達情況與相關臨床資料之間的關系，單因素生存分析對臨床各項指標與結腸癌生存期進行相關性分析，建立Cox比例風險回歸模型，綜合探討臨床各因素和X、Y表達與結腸癌肝轉移、轉移灶形成及預后的相關性。

2.2 體外、體內水平研究X、Y基因在腸癌肝轉移中的調節功能

1) 制備X-shRNA慢病毒，建立X穩定沉默的細胞株，以無義序列作為陰性對照，利用MTT實驗觀察X沉默后細胞的生長曲線；克隆形成實驗檢測X沉默后細胞的克隆形成能力；流式細胞術結合PI單染、Annexin-V雙染檢測細胞周期和凋亡情況；細胞劃痕實驗、Transwell實驗觀察細胞運動能力的變化。與此同時，制備過表達X的慢病毒載體。

2) 在穩定沉默X的結腸癌細胞中，導入過表達Y的慢病毒載體，利用細胞生長曲線觀察X沉默且Y過表達后細胞的增殖能力變化；細胞劃痕實驗、Transwell實驗觀察細胞運動能力的變化。同樣地，在穩定沉默Y的結腸癌細胞中，導入過表達X的慢病毒載體，利用細胞生長曲線觀察Y沉默&X過表達后細胞的增殖能力變化；細胞劃痕實驗、Transwell實驗觀察細胞運動能力的變化。

3) 制備結腸裸鼠皮下移植瘤模型，觀察腫瘤生長情況，建立生長曲線，統計分析Y和X對結腸癌細胞體內成瘤能力的影響，明確Y和X在結腸癌惡性增殖的作用。實驗分組：空白對照、Y沉默組、X沉默組、X沉默組+Y過表達組、Y沉默組+X過表達組。

4) 建立結腸癌肝轉移動物模型，觀察肝臟中的轉移灶，統計分析Y和X對結腸癌肝轉移能力的影響，明確Y和X在結腸癌肝轉移過程中的作用。實驗分組：空白對照、Y沉默組、X沉默組、X沉默組+Y過表達組、Y沉默組+X過表達組。

5) 處死裸鼠取得的腫瘤組織，利用qRT-PCR和免疫組化方法檢測Y/X以及下游半乳糖苷酶的mRNA和蛋白的表達；部分腫瘤組織制備成冰凍切片，利用FITC和TRITC雙標記免疫熒光染色，使用激光共聚焦顯微鏡觀察X與Y的共定位情況。

2.3. X-Y軸調節結腸癌肝轉移的分子機制研究

1) 通過基因芯片Microarray分析X過表達/沉默后基因表達譜變化情況，對原始數據進行歸一化、標準化，差異表達分析，明確X消減后表達發生改變的下游調控分子，芯片結果中有顯著差異的潛在作用分子，設計引物，通過qRT-PCR進行二次表達驗證。

2) X基因過表達/沉默后發生顯著表達差異的基因，利用Bayesian Network、Genes2Networks、Go-anaslysis軟件進行signaling network 重建。解析X調控結腸癌細胞運動能力的信號通路網絡，構建X為核心的信號分子網絡。

3) 根據X基因沉默后影響的信號通路結果（半乳糖基轉移酶及其上游調節信號通路），利用信號通路抑制劑處理X穩定過表達/沉默后結腸癌細胞和對照細胞，檢測不同分子信號對X表達及功能的作用，驗證阻斷這些信號通路后對X在結腸癌中的功能表型的影響。

4) 采用信號通路高通量檢測蛋白芯片，根據以上實驗分析的通路情況，訂購相應通路的Pathway Array試劑盒，按試劑盒操作，依據封閉、加入細胞裂解液、洗脫、加入抗體混合液、再次洗脫，加入辣根過氧化物酶HRP并洗脫、信號檢測的步驟，檢測X基因表達變化后的特定通路關鍵蛋白的變化。

5) 分別構建X、Y的真核表達載體，共轉293T，通過免疫共沉淀（Co-IP）驗證XY的相互結合作用。

6) 應用生物信息學技術模擬X與Y的結合位點。在結合位點制備不同氨基酸的突變體。采用RNAi方法敲減互作蛋白表達，接著轉入互作蛋白的突變體，檢測細胞功能表型變化。通過免疫共沉淀（Co-IP）驗證X與Y之間的結合位點特異性。

7) EMSA實驗驗證X與Y之間的相互作用關系，參考蛋白相互作用實驗，設計突變載體，再驗證其結合特異性，由此揭示X作為Y調節蛋白其對下游RNA進行調控的精細機制。

3. 可行性分析

1) 研究目標切實可行：我們前期的工作已明確證實：Y可以調節結腸癌的惡性增殖，并且進行了大量的預實驗，可支持本課題主要科學假設。本項目是對前期研究工作的進一步補充和完善，具有較好的可行性。

2) 技術平臺與硬件設施完善：課題組成員長期從事結直腸癌的診治和發生發展機制研究，在免疫組化、免疫印跡、實時熒光定量PCR、RNA 干擾、慢病毒包裝、表達譜芯片研究等各個方面積累了大量的經驗，本項目中所用到的實驗技術以前均有所涉及，為本項目的實施提供了技術保障。本項目所需的主要儀器設備目前均已經具備。

3) 研究基礎扎實：本課題組成員長期從事結直腸癌的基礎和臨床研究，具有良好的科研素質。在國內外雜志上發表了多篇結直腸癌基礎研究和臨床研究相關的論文。

4) 臨床標本充足：仁濟醫院普外科長期從事結直腸癌的診治，已經建立一套規范化的結直腸癌診療體系，擁有大量結直腸癌手術標本(每年1000余例)，能夠保證課題所需大量的結直腸癌標本的要求。

5) 團隊年輕優秀、成員配備合理：課題組成員大部分為中青年業務骨干，熱愛科學研究，有較強的創新能力，能為實驗投入大量的時間，每個人均有自己的研究專長，能保障本實驗的順利完成。

4. 本項目的特色與創新之處

1) 思路上創新：X和Y是Z家族中具有相互作用的一對分子，他們在結腸癌肝轉移的過程中發揮差異性的功能。針對X-Y軸進行組合策略研究，能夠解決更多維度的科學問題，對臨床具有指導意義；

2) 內容上創新：X-Y軸在結腸癌癌中的功能作用和與癌變的關系還是未知領域，我們首先鑒定了Y，隨后對Y和X的交互作用進行研究，能夠進一步形成創新的研究成果。

5. 研究工作的進度安排

本項目預計在4年內完成，具體進展計劃如下：

? 2015.01－2015.12：定量PCR檢測結腸癌及結腸癌肝轉移新鮮組織標本中X和Y表達，分析臨床病理及預后的相關性；X和Y基因過表達和shRNA慢病毒構建、包裝和純化，細胞功能檢測；

? 2016.01－2016.12：免疫組化檢測結腸癌及結腸癌肝轉移標本中Y和X表達，分析臨床病理及預后的相關性；X和Y影響結腸癌肝臟轉移和惡性增殖的動物實驗。

? 2017.01－2017.12：Pathway array分析X和Y調控結直腸癌細胞轉移的信號通路網絡；生物信息學分析與分子驗證，通路抑制劑驗證。

? 2018.01－2018.12：Co-IP實驗驗證X與Y之間的相互作用關系。蛋白結合位點突變載體制備及其結合特異性驗證。

6. 預期研究結果

1）闡明X和Y表達在腸癌中的臨床意義；

2）解析X-Y調節軸在結腸癌肝轉移中的功能及相互作用機制；

3）在國際學術刊物上發表SCI收錄學術論文3篇，至少1篇IF>5；

4）申請專利1項；

5）培養博士研究生1名，碩士研究生2名。

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