標簽蛋白融合技術概述從分子生物學基礎和生化基礎到商

2023年12月12日發(作者：工程等級如何劃分)

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標簽蛋白融合技術概述：從分子生物學基礎和生化基礎到商用系統K. Terpe

摘要： 隨著蛋白質組學的迅猛發展，重組蛋白質的使用在近年來大大增加。重組雜合體含有一個多肽融合擔體也就是親和標簽可用于輔助目標蛋白的純化，這已經被廣泛使用。許多不同的蛋白質，結構域或者肽類能與目標蛋白融合。利用融合蛋白的有助于重組蛋白純化和檢測這個優點被廣泛贊同。然而，很難選擇正確的純化系統用于特定的目標蛋白。本綜述概述了使用最頻繁的和有趣的系統：精氨酸標簽（Arg－tag），鈣調蛋白結合肽（calmodulin-binding

peptide），纖維素結合結構域（cellulo-binding domain），DsbA，c-myc-tag，谷胱甘肽S－巰基轉移梅（glutathione S-transfera）, FLAGtag,HAT-tag, His-tag, 麥芽糖結合蛋白（malto-binding protein）, NusA, Stag,SBP-tag, Strep-tag,和硫氧還蛋白等。

引言

生產高度純化和性狀確切的重組蛋白質已成為在醫藥工業工作的蛋白質化學家的主要任務，近年來，一些抗原表位的肽類和蛋白質已被用于大量生產重組蛋白質。這些親和標簽系統具有以下特征：（a）一步的吸附純化，（b）對三級結構和生物活性影響小，（c）可方便且專一的去除以產生天然蛋白質，（d）在純化過程中重組蛋白的分析簡便準確，（e）適用于大量的不同蛋白質。然而，每一個親和標簽都在其特定的緩沖液條件下純化得到（表1）。因此有幾種不同的策略用于大規模生產重組蛋白質。其中一種辦法是使用很小的肽標簽，這些標簽不會與融合的蛋白質發生干擾。使用最為廣泛的有多聚精氨酸，FLAG-，多聚組氨酸-, c-myc-, S-, and Strep

II-tag. 對于某些應用，小標簽無需去除。這些標簽不像大標簽具有免疫原性，經常可以直接作為抗原用于產生抗體。 小標簽對于融合蛋白的三級結構和生物活性的影響取決于標簽的位置和氨基酸組成 (Bucher etal. 2002)。另一種方法是使用大的肽類或蛋白質作為融合擔體。大擔體的使用可以增加目標蛋白的溶解性。缺點是對于一些應用如結晶或抗體產生等，標簽必須加以去除。一般來說，對于特定的目標蛋白很難決定最佳的融合系統。這取決于目標蛋白本身(如穩定性，疏水性)，表達系統，純化后蛋白的用途。本綜述概述了使用最頻繁的和有趣的標簽-蛋白融合系統（表2）。

多聚精氨酸－標簽(Arg-tag)

精氨酸－標簽最早在1984年首次描述(Sasnfeld和 Brewer 1984)，通常由5或6個精氨酸組成。它已被成功用作細菌C末端標簽，產生的重組蛋白質純度高達95％，得率達到44％。精氨酸是堿性最強的氨基酸，帶5個精氨酸標簽的蛋白質可以結合到陽離子交換樹脂SP-Sephadex上, 而大部分雜蛋白不結合。結合后，帶標簽的蛋白質在堿性pH下運行線性NaCl梯度洗脫得到。當C末端為疏水性區域時，多聚精氨酸可能影響蛋白質的三級結構(Sasnfeld和Brewer 1984). 來自Pyrococcus furiosus的帶精氨酸標簽的麥芽葡聚糖結合蛋白已獲得結晶(Bucher et al.2002)。天然蛋白質的晶體在視覺上是分辨不出差別的，然而晶體在鑲嵌圖案和衍射圖譜上有差別。精氨酸殘基的C末端序列可用羧肽酶B處理去除。這一酶促處理已被成功用于一些例子，但常常由于低的切割得率或者在期望的蛋白質序列間發生不必要的切割而受到限制(Nagai和 Thogerson

1987)。精氨酸標簽可用于在扁平表面固定化功能蛋白質；這對于研究其與配體的相互作用是重要的。GFP在其末端加上6個精氨酸標簽可以通過這一序列可逆、專一結合到云母的表面，這已經作為電子掃描電鏡應用的標準底物（Nock et al.1997）。 然而精氨酸標簽并不常用，與第二標簽聯用是很有趣的蛋白質純化工具。

多聚組氨酸-標簽(His-tag)

已廣泛采用的方法是利用固定化金屬螯合層析純化帶有由多聚組氨酸殘基組成的一個短的親和標簽的重組蛋白質。固定化金屬螯合層析（ IMAC; 由Porath et al. 1975提出）的基礎是固定2+2+2+2+在基質上的過渡態金屬離子(Co, Ni,Cu, Zn)與特定的氨基酸側鏈之間的相互作用。組氨酸是與固定化金屬離子作用最強的氨基酸，組氨酸的咪唑環作為電子供體容易與固定的金屬離子形成配位鍵。含有連續組氨酸殘基序列的肽類可在IMAC中有效保留。基質材料洗滌之后，可通過調節柱緩沖液的pH或者添加游離咪唑洗脫含多聚氨基酸序列的肽類(表 1)。純化帶組氨酸殘基的蛋白質的方法首次于1987年提出（Hochuli et al. 1987）。Hochuli開發了亞硝基三乙酸

(NTA)吸附劑用于金屬螯合親和層析。NTA 樹脂形成四齒的螯合物，非常適合與金屬離子形成6價配位鍵，2價用于可逆保留生物高分子。帶有多聚組氨酸標簽的二氫葉酸還原酶在1988年通過

2+Ni-NTA基質成功分離(Hochuli et al. 1988)。這一系統的純化效率取決于多聚組氨酸的長度和溶解系統(表 3)。 雖然在變性條件下系統對于帶6個組氨酸標簽的蛋白質純化有效，帶3個組氨酸標簽的蛋白質在生理條件下可有效純化。然而帶6個組氨酸標簽的蛋白質可以在天然條件2+下、在低或高濃度鹽的緩沖液中結合到Ni-NTA 基質上。結合后，目標蛋白可用0.8到250 mM咪唑梯度洗脫。低濃度的咪唑（如0.8 mM）可減少帶有組氨酸的宿主蛋白質的非專一吸附。6個組氨酸標簽的蛋白質可用20到250mM咪唑濃度范圍洗脫 (Hefti et al. 2001；Janknecht et

al.1991)。 使用咪唑的缺點是咪唑會影響NMR試驗，競爭性試驗研究和晶體學試驗，咪唑的存在經常導致蛋白質的聚集(Hefti et al. 2001)。另一種用于純化多聚組氨酸標簽蛋白質的材料2+2+是TALON。這由Co-羧甲基天冬氨酸(Co-CMA)組成，并偶聯到固相的樹脂上。TALON使得標簽蛋2+白在溫和條件下洗脫，已有報導與Ni-NTA樹脂相比，其非特異性蛋白結合更少，從而達到更高的洗脫產物純度(Chaga et al. 1999a, b)。一種酶制劑通過SDS-PAGE鑒定的純度高于95％。利2+用Co-CMA純化可以使用的天然多聚組氨酸親和標簽長達19個氨基酸殘基(HAT-tag;序列見表2) 。氯霉素乙酰基轉移酶, 二氫葉酸還原酶和綠熒光蛋白在N末端加入HAT標簽可在溫和條件下一步純化純度大于95％。平衡緩沖液和上樣緩沖液中添加5mM 咪唑去除結合較弱的非專一蛋白質吸附，而用150mM 咪唑洗脫HAT標簽的蛋白質。也可降低pH到5.0洗脫標簽的蛋白質。與鹽酸胍相比，尿素對于HAT標簽蛋白質結合力的降低作用更強。然而HAT標簽蛋白的過量表達試驗僅在細菌中獲得證實。多聚組氨酸親和標簽通常置于重組蛋白質的N端或C端。最佳的標簽放置位置是針對特定的蛋白質而言的。純化多聚組氨酸標簽蛋白已成功用于大量的表達系統包括細菌(Chen 和 Hai 1994； Rank et al.2001)， 酵母(Borsing et al. 1997； Kaslow和 Shiloach

1994)，哺乳細胞 (Janknecht et al. 1991； Janknecht 和 Nordheim 1992), 以及桿狀病毒感染的昆蟲細胞(Kuusinen et al. 1995；Schmidt et al. 1998)。超過100種結構的組氨酸標簽蛋白質登記在蛋白質數據庫中（Protein Data Bank）。 具有組氨酸標簽的蛋白質在鑲嵌圖案和衍射圖譜與天然蛋白相比變化不大(Hakansson etal. 2000)。雖然多聚組氨酸親和標簽因為相對較小且帶電荷而幾乎不影響蛋白質的活性，但是通常并不能排除親和標簽影響其蛋白質活性的可能(Wu 和Filutowicz 1999)。將親和標簽移到另一端(Halliwell et al. 2001)或者在變性條件下進行純化可以解決這個問題。由于金屬離子可吸附到NTA樹脂，帶金屬離子中心的蛋2+白質不推薦用該法純化。由于Ni-NTA可被還原，在厭氧條件下也不推薦使用該辦法。然而利用組氨酸標簽純化蛋白質是通常使用的辦法。

表1 親和標簽和基質洗脫條件

親和標簽 基質 洗脫條件

Poly-Arg 陽離子交換樹脂 在堿性pH>8.0 NaCl線性梯度0－400mM

2+2+Poly-His Ni-NTA, Co-CMA （Talon） 150 mM 咪唑或低 pH

FLAG Anti-FLAG 單抗 pH 3.0 或 2–5 mM EDTA

Strep-tag II Strep-Tactin (修飾的鏈球菌抗2.5 mM 脫硫生物素

生物素蛋白)

c-myc 單抗 低pH

S RNaA酶 的S片斷 3M硫氰酸胍，

0.2M 檸檬酸pH 2，3M 氯化鎂

HAT (天然組氨酸親Co2+-CMA (Talon) 150 mM 咪唑或低 pH

和標簽)

鈣調蛋白結合肽 鈣調蛋白 EGTA 或1 M NaCl中加 EGTA

纖維素結合結構域 纖維素 1型：鹽酸胍或者尿素大于4M SBP

殼聚糖結合結構域

Streptavidin（鏈球菌抗生物素蛋白）

殼聚糖

2/3型：乙二醇

2 mM 生物素

內含子融合：30－50mM 二硫蘇糖醇,β巰基乙醇，或半胱氨酸

5－10mM 還原型谷胱甘肽

10mM 麥芽糖

谷胱甘肽S－巰基轉谷胱甘肽

移酶

麥芽糖結合蛋白 交聯淀粉

表2 親和標簽的序列和大小

標簽 殘基

Poly-Arg 5-6

(通常5個)

Poly-His 2－10

(通常6g)

FLAG 8

Strep-tag II 8

c-myc 11

S 15

HAT 19

3x FLAG 22

鈣調蛋白結合肽 26

纖維素結合結構域 27–189

SBP 38

殼聚糖結合結構域 51

序列

RRRRR

HHHHHH

DYKDDDDK

WSHPQFEK

EQKLISEEDL

KETAAAKFERQHMDS

KDHLIHNVHKEFHAHAHNK

DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK

KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL

結構域

MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP

TNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEPSNVPALWQLQ

蛋白質

大小

（KDa）0.80

0.84

1.01

1.06

1.20

1.75

2.31

2.73

2.96

3.00–20.00

4.03

5.59

谷胱甘肽S-巰基轉211 26.00

移酶

麥芽糖結合蛋白 396 蛋白質 40.00

2+表3 在6M鹽酸胍和0.05M磷酸鹽緩沖液中對于Ni-NTA吸附劑的親和力(Hochuli et al.1988)

磷酸 鹽 鹽酸胍

截留(%) 洗脫(%) 截留(%) 洗脫(%)

多聚組氨酸二氫葉酸還原酶

(His)2-DHFR 30 10 <5 –

(His)3-DHFR 90 75 <10 –

(His)4-DHFR >90 30 10 10

(His)5-DHFR >90 20 50 50

(His)6-DHFR >90 10 >90 90

DHFR-(His)2>90 90 <5 –

DHFR-(His)3>90 80 <10 –

DHFR-(His)4>90 50 10 10

DHFR-(His)5>90 40 50 50

DHFR-(His)6>90 30 >90 90 FLAG-標簽

FLAG-標簽系統利用一短的親水性8氨基酸肽（表1）并融合到目標蛋白（Hopp et al. 1988）。

FLAG肽可與抗體M1結合。結合是否是鈣離子依賴性的(Hope et al. 1996)或者無關的(Einhauer

和Jungbauer 2000)仍有爭議。FLAG-GFP的動力學結合試驗通過 BIACORE分析，結果表明在有無2+Ca離子存在下是一致的。其他目標是單抗M2和M5,每一個都具有不同的識別和結合特性。FLAG-標簽 可位于蛋白質的C端或N端。這一系統已用于各種各樣的細胞類型，包括細菌(Blanar 和Rutter 1992， Su et al. 1992),酵母(Einhauer et al. 2002；Schuster et al.2000)和哺乳細胞 (Kunz et al. 1992; Zhang et al. 1991)。該系統的純化條件是非變性的，因此可以純化有活性的融合蛋白，復合物的解離可通過添加螯合劑如EDTA或瞬間降低pH得到(表1)。這一系2+統的缺點是單抗純化基質不如其他基質穩定如Ni-NTA 或者 Strep-Tactin。分離得到的蛋白質純度在90%左右(Schuster et al. 2000)。通常小標簽可用專門的單抗加以檢測。為了改善FLAG標簽的檢測，已開發出3x FLAG系統。這一三聯體FLAG抗原表位是親水的，由22個氨基酸組成（表2）且可以檢測表達低到10fmol水平的融合蛋白。來自Pyrococcus furiosus的帶FLAG標簽的麥芽葡聚糖結合蛋白已獲得晶體(Bucher et al. 2002)，晶體質量與無標簽的蛋白質晶體非常相似。最后，FLAG-標簽可加腸激酶處理去除，腸激酶專一識別該肽序列C末端的5個氨基酸殘基 (Maroux

et al. 1971)。

Strep-標簽（Strep-tag）

Strep-標簽是一氨基酸肽開發來用于在鏈球菌抗生物素蛋白（streptavidin）柱上親和純化相應的融合蛋白(Schmidt和Skerra 1993)。鏈球菌抗生物素蛋白（streptavidin）在特定位點第44, 45, 和47位的突變體與天然形式相比，對八肽Strep-tag II的親和力更強(序列見表2，Schmidt et al. 1996；Voss和Skerra 1997；Kornd_rfer 和Skerra 2001)。這一鏈球菌抗生物素蛋白突變體稱為Strep-Tactin。Strep標簽的蛋白質在生理緩沖液條件下結合到生物素結合區域中，并可用生物素衍生物溫和洗脫。洗脫時推薦使用2.5 mM脫硫生物素。基質可以用4－羥基－偶氮苯－2－羧酸再生，這種物質在溶液中呈黃色，當結合到基質上則呈紅色。結合條件是非常專一的。生物素化的蛋白質如大腸桿菌的羧基載體蛋白可以結合到Strep-Tactin上,但生物素或者生物素化的蛋白質則用抗生物素封閉。純化條件是多種多樣的。螯合劑，溫和性去污劑，還原型去污劑，和高達1M的鹽可以加到緩沖液中。變性的純化條件如6M 尿素可破壞Strep-tag/Strep-Tactin 相互作用，但不破壞Strep-Tactin。標簽與Strep-Tactin的作用接近1μM (Voss和 Skerra 1997)。融合蛋白可以通過Strep-Tactin嵌合物或抗體專一地檢測。標簽可以加在蛋白質的C端或N端。重組Strep-標簽-雜合體在細菌（Fontaine et al. 2002）,酵母(Murphy 和Lagarias 1997),哺乳系統(S_rdy et al. 2002；Smyth et al. 2000),植物(Drucker

et al. 2002)和桿狀病毒感染的昆蟲細胞中都有產生。這一方法被推薦用于在厭氧條件下純化帶小標簽的有活性的融合蛋白 (Hans 和Buckel 2000；Juda et al. 2001)以及含金屬離子的酶。標簽蛋白也有可能整合到膜中(Gro? et al. 2002)。那些不帶標簽的膜蛋白亞基則不會被同時純化。這一標簽的特殊用途是它可用于真核表面展示(Ernst et al. 2000)。Strep-Tactin結合生物素和Strep-標簽的相容性被用于觀測EF0EF1-F-ATPa酶 c-亞基寡聚體的旋轉(P?nke et

al. 2000)。近年來Strep-標簽的使用大大增加。具有該標簽的重組蛋白質可用于NMR和結晶實驗研究(Ostermeier etal. 1997)。Strep-標簽系統適合用于研究蛋白質之間的相互作用以及當那些大的標簽或者帶電荷的標簽無效時的特殊用途。

c-myc-標簽

在1985年開發出鼠抗c-myc抗體9E10(Evan et al. 1985)并被作為免疫化學試劑用于細胞生物學和蛋白質工程領域中。抗體的11個氨基酸抗原表位（表2）表達在不同的蛋白質框架中仍可識別9E10免疫球蛋白(Munro和 Pelham 1986)。 c-myc-標簽已成功應用在 Western-blot雜交技術,

免疫沉淀和流式細胞計量術中(Kipriyanov 1996)。因此可用于監測重組蛋白質在細菌(Dreher

et al. 1991；Vaughan et al. 1996),酵母(Sequi-Real et al. 1995； Weiss et al. 1998),

昆蟲細胞(Schioth et al. 1996), 和哺乳細胞 (McKern 1997； Moorby 和 Gherardi 1999)中的表達情況。表達在經土壤細菌轉化的Arabidobsis細胞中的作用蛋白也有成功進行共免疫純化的報導(Ferrando et al. 2001)。c-myc-標簽的蛋白質可通過偶聯9E10單抗到二乙烯砜活化的瓊脂糖上而進行親和純化。洗滌條件是生理條件的，接著用低pH洗脫。而低pH往往降低蛋白質的活力。純化的c-myc標簽蛋白質已獲得結晶(McKern et al.1997)。c-myc-標簽可放在C端或N端(Manstein et al. 1995)。這一系統廣泛用于檢測但很少用于純化。

S-標簽

S-標簽是個融合肽標簽可以通過快速靈敏的均勻分析或者在Western blot中用比色法加以檢測。該系統的基礎是15個氨基酸殘基的S-tag（表2）與103氨基酸殘基的S-蛋白質之間的強烈相互作用，這兩個都來自RNaA(Karpeisky et al.1994； Kim 和 Raines 1994)。S-蛋白質/S-標簽復合物的Kd接近0.1μM，這取決于pH，溫度和離子強度(Connelly et al. 1990)。標簽由4個帶正電荷殘基，3個負電荷殘基，3個不帶電的極性殘基和5個非極性殘基組成。這使S-標簽保持可溶。S-標簽的快速分析是基于核酸降解活力的恢復。標簽蛋白可以結合到S蛋白質基質上。洗脫條件較苛刻，如pH2.0的緩沖液（表1）。然而為了獲得有功能的蛋白質推薦用蛋白酶切割標簽。該系統可用于純化的重組蛋白質來源包括細菌(Lellouch和Geremia 1999)，哺乳細胞和桿狀病毒感染的昆蟲細胞抽提物。該系統經常與第二標簽聯用。RNa酶A高度靈敏的熒光底物的發現使得該系統可用于與高通量篩選聯用的檢測(Kelemen etal. 1999)。

鈣調蛋白結合肽

1992年首次提出了含鈣調蛋白結合肽的融合蛋白質的純化(Stofko-Hahnet al. 1992)。該肽含來自骨骼肌的肌漿球蛋白輕鏈激酶的C端26個殘基（序列見表2）。它在0.2mM CaCl2存在下與鈣調蛋白的親和力可達納摩爾水平(Blumenthal et al. 1985)。緊密的結合可以進行使洗滌更嚴謹，確保僅少量的雜蛋白與融合蛋白共純化。如果在第一步蛋白質沒有完全洗脫下來，可進一步用EGTA和1M NaCl洗脫。由于沒有可與鈣調蛋白相互作用的內源蛋白質，該系統在純化大腸桿菌的重組蛋白時具有很高的專一性。融合蛋白的回收率在80－90％。該系統可耐受還原劑和高達0.1％的去污劑(Vaillancourt et al. 2000)。真核細胞的純化則不是很理想，因為有許多內源蛋白質可與鈣調蛋白作用，也是鈣離子依賴型的(Head 1992)。對于使用蛋白激酶A進行γ[32]ATP同位素標記來說，鈣調蛋白結合肽凝血酶融合標簽是個極好的對象(Vailancourt et al.

2+2000)。組氨酸標簽的激酶可通過Ni-NTA 層析去除。這可以用于研究蛋白質之間的相互作用或者噬菌體表達庫篩選。鈣調蛋白結合肽可放在N端或C端。鈣調蛋白結合肽放在N端可能降低翻譯的效率，而在C端則可高表達（Zheng et al. 1997）。

纖維素結合結構域

具有纖維素結合結構域（CBDs）的蛋白質種類已超過13種。CBD大小從4到20KDa，出現在多肽內的不同位置：N端，C端，或者中間。一些CBD與纖維素不可逆結合，因此可用于固定有活力的酶類(Xu etal. 2002)；其它則可以結合，因此可用于分離和純化。I型的CBD與透明的纖維素可逆結合，可作為親和層析的有用標簽。氫鍵的形成和范德華作用是結合的主要的推動力(Tomme et

al. 1998)。 纖維素的優點是它是惰性的，非專一的親和力低，它具有多種形式，也已經被批準用于許多藥物和人類的使用。CBD在相當寬的pH范圍內，從3.5到9.5，均可與纖維素結合。標簽可放在目標蛋白的N端或C端。標簽的親和力如此強，以致結合的融合蛋白需要用含有尿素或鹽酸胍的緩沖液才能解離。這種變性的洗脫條件需要復性融合的目標蛋白。與II和 III型的CBD融合的蛋白質用乙二醇即可從纖維素上溫和洗脫(McCormick和Berg 1997)。這種低極性的溶劑被推測破壞了結合位點的疏水作用。乙二醇可通過透析去除。重組CBD雜合體已在細菌，酵母，哺乳細胞和桿狀病毒感染的昆蟲細胞中產生(Tomme et al. 1998)。

SBP-標簽

SBP-標簽是一種新的鏈球菌抗生物素蛋白（streptavidin）結合肽，由38個氨基酸組成(序列見表2；Wilson et al. 2001)。標簽與streptavidin的解離常數為2.5nM。SBP-標簽蛋白質可用固定化的streptavidin進行純化。洗脫條件非常溫和，用2mM生物素。C端SBP標簽的蛋白質已在細菌中表達并成功純化(Keefe et al. 2001)。對于進一步的應用還不多，但這一標簽似乎成為在包被有streptavidin的芯片上固定化蛋白質的有趣工具。

殼聚糖結合結構域 來自環狀桿菌的的殼聚糖結合結構域由51個氨基酸組成(Watanabe et al. 1994)。 親和標簽通常與自切內含子聯用。通常使用的內含子來自釀酒酵母的VMA1基因, 編碼454個氨基酸(Chong

et al. 1996, 1997)。其他短的內含子也有使用(Xu et al. 2000)。硫酯鍵的自切可用硫醇試劑如1,4-二硫蘇糖醇或者β-巰基乙醇誘發 (表2)。 目標蛋白的C端或N端殘基可影響體內和體外的切割（Xu et al. 2000）。高濃度鹽或者非離子型去污劑可用于降低非專一結合，從而增加純度。當目標蛋白洗脫時，未切割的融合前體和內含子蛋白質標簽仍結合在殼聚糖樹脂上，再用1％SDS或者6M鹽酸胍清除。C端或者N端融合殼聚糖結合結構域的蛋白質已在細菌中表達(Cantor 和 Chong 2001； Sweda et al. 2001； Wie et al. 2001)。

谷胱甘肽S－轉移酶-標簽

1988年首次描述了融合有谷胱甘肽S－轉移酶（GST）的多肽的一步純化(Smith 和 Johnson

1988)。來自日本血吸蟲（schistosoma japonicum）、26-kDa的 GST(Taylor et al. 1994)被克隆在大腸桿菌表達載體中。融合蛋白可從未經處理的裂解液中用固定化的谷胱甘肽親和層析加以純化。結合的融合蛋白在非變性條件下用10mM 還原型谷胱甘肽洗脫。在大多數情況下，融合蛋白在水溶液中是可溶的，并形成二體。GST標簽可用酶學分析或免疫分析很方便的檢測。標簽有助于保護重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其穩定性。在大多數情況下GST融合蛋白是完全或部分可溶的。仍不清楚那些導致不溶解的因素，但一些例子是GST融合蛋白不溶解與疏水區域的存在有關。其它不溶的融合蛋白或是富含帶電荷殘基或者分子量大于100kDa。有時候如果不溶的融合蛋白在1% Triton X-100，1％Tween, 10mM DTT，0.03% SDS或1.5％sarcosyl緩沖液中是可溶的話，也可進行親和層析純化（Frangioni和Neel 1993）。Sarcosyl抑制蛋白質與細菌外膜組分的共聚集。其它不溶蛋白的純化必須采用常規的辦法。推薦采用位點專一的蛋白酶如凝血酶或Xa因子從融合蛋白切除GST標簽。PreScission 蛋白酶含有帶GST-標簽的人鼻病毒3C蛋白酶；蛋白酶解后，GST載體和蛋白酶通過谷胱甘肽瓊脂糖親和層析去除。GST標簽可位于N端或C端，可用于細菌 (Smith 和Johnson 1988),酵母(Lu et al. 1997),哺乳細胞(Rudert et al.

1996), 和桿狀病毒感染的昆蟲細胞(Beekman et al. 1994)。 GST融合蛋白已成為分子生物學家的基本工具。它廣泛用于研究蛋白質－DNA相互作用(Beekman et al. 1994；Lassar et al.

1989)，蛋白質-蛋白質相互作用(Mayer et al. 1991；Ron 和 Dressler 1992) 也作為抗原用于免疫學或疫苗研究(McTigue et al. 1995)。

麥芽糖結合結構域

40kDa的麥芽糖結合蛋白(MBP)由大腸桿菌K12的malE基因編碼(Duplay et al. 1988)。1988年首次報導了通過與MBP融合的載體來促進外源蛋白在大腸桿菌中的表達和純化(Di Guan et al.

1988)。融合蛋白可通過交聯淀粉親和層析一步純化。結合的融合蛋白可用10mM麥芽糖在生理緩沖液中進行洗脫。結合親和力在微摩爾范圍。一些融合蛋白在0.2% Triton X-100或0.25% Tween

20存在下不能有效結合，而其他融合蛋白則不受影響。 緩沖條件為pH7.0到8.5，鹽濃度可高達1M。不能使用變性劑。MBP可增加在細菌中過量表達的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白(Sachdev和Chirgwin 1999)。編碼10個天冬酰胺殘基的手臂序列插入到MBP和目標蛋白之間可增加特殊融合的機會，而這種特殊的融合（蛋白）將與淀粉樹脂緊密結合。MBP標簽可通過免疫分析很方便的檢測。有必要用位點專一的蛋白酶切割標簽。如果蛋白在細菌中表達，MBP可以融合在蛋白的N端或C端(Sachdev 和 Chirgwin 2000)。放在N端可能降低翻譯的效率。MBP系統與小的親和標簽聯用而廣泛使用(Hamilton et al. 2002； Podmore和 Reynolds 2002) 。

NusA, TrxA 和 DsbA

當外源蛋白質在大腸桿菌中生產時的一個缺點是蛋白質經常聚集成不溶的折疊中間體，也就是包涵體。為了獲得有活力的蛋白質，必須使用變性劑如8M尿素或6M鹽酸胍溶解。避免包涵體的一種可能是使用大的親和標簽如GST或者MBP。親水標簽，如轉錄終止抗終止因子(NusA)，大腸桿菌硫氧還蛋白(TrxA)，或者蛋白質二硫鍵異構酶I(DsbA)可增加溶解性。缺點是帶有這些標簽的蛋白質不能用專門的親和基質純化。融合蛋白構建時必須與可用于純化的小親和標簽聯用。尤其是當NusA蛋白增加了融合蛋白的溶解性時(Davis et al. 1999)。一般來說，大腸桿菌NusA蛋白促進發夾狀折疊和終止(Gusarov和 Nudler 2001)。一些在大腸桿菌中表達時不溶的蛋白質與NusA在N端融合時則變成可溶。NusA經常與組氨酸標簽聯合使用(Harrisson 2000)。 硫氧還蛋白可以融合在目標蛋白的C端或N端(Katti et al. 1990; LaVallie et al. 2000)，但通常將trxA放在5'末端。DsbA增加目標蛋白在大腸桿菌胞質和周質中的溶解性。推薦采用位點專一的蛋白酶從融合蛋白切割NusA, TrxA或DsbA。切割位點可用作連接肽。

其他標簽系統

也有其他在用的標簽系統，在本綜述中沒有詳細闡述：葡萄球菌蛋白A基因融合載體被開發來利用IgG親和層析純化融合蛋白 (Uhl_n et al. 1983; Nilsson et al. 1985) 。這一蛋白由于可與許多種屬包括人類的免疫球蛋白的FC區域專一結合而非常適用于親和純化。與蛋白A相似，來自鏈球菌菌株G148的蛋白G也由于可與IgG的FC區結合而同樣適用 (Goward et al. 1990) 。使用小肽標簽的蛋白質的生物素化通常用于檢測，固定化以及純化(Cronan 1990) 。不同的標簽，如AviTag, PinPoint Xa蛋白純化系統，和Bio-tag (Schatz 1993; Tucker和 Grisshammer 1996)也進行了描述。 噬菌體The T7和V5 抗原表位是用于靈敏檢測的有趣標簽。其他用于檢測的抗原表位有: ECS (腸激酶識別位點), HA (血粘素A), 和谷氨酸-谷氨酸。

標簽的切割

親和標簽的存在可能影響待研究蛋白的重要特性或功能。可以通過位點專一的蛋白酶去除目標蛋白的標簽，且切割不能降低蛋白質的活力。切割后蛋白酶的去除對于使用帶親和標簽的重組蛋白酶或者生物素化的蛋白酶較為容易。生物素化的蛋白酶可通過Strep-tag/Strep-Tactin親和層析直接加以純化，或者通過第二步鏈球菌抗生物素蛋白親和層析。標簽的切割不加蛋白酶也是可行的，可加入自切位點(Xu etal. 2000). 最普遍使用的蛋白酶是：腸激酶，煙草蝕刻病毒(TEV),凝血酶，和Xa因子。目標蛋白的回收取決于切割效率。腸激酶由于專一識別5個氨基酸多肽(D-D-D-D-K-X1)并在賴氨酸的羧基上切割，是N末端融合通常選擇的蛋白酶，在其他殘基的不規則切割發生水平較低，這取決于蛋白質底物的構象(Choi et al.2001)。 腸激酶輕鏈的分子量為26.3kDa. 一個單位定義為在23℃下切割50ug 融合蛋白在8小時內達到95％切割率所需的酶量。生化分析已經表明切割效率取決于D4K識別位點下游的X1 氨基酸殘基(Table 4;

Hosfield 和Lu 1999)。與其他標簽不同， FLAG-tag (DYKDDDK) 具有內在的腸激酶識別位點。

TEV 蛋白酶是位點專一的蛋白酶，具有7個氨基酸殘基的識別位點，序列為 E-XX-Y-X-Q-S, 切割在兩個保守的谷氨酰胺和絲氨酸之間進行 (Dougherty et al. 1989)。 X可以是各種氨基酸，但不是全部氨基酸都可行。最佳的切割序列為 E-N-L-Y-F-Q-S (Carrington 和 Dougherty 1988;

Doughery et al. 1988)。當TEV蛋白酶識別位點在兩個結構域之間是結果最理想。當切割不理想時，插入增加結構靈活性的小連接肽可改善效率。 高專一性，多種底物的活力以及低溫下的有效切割使TEV蛋白酶成為從融合蛋白移除標簽的理想工具(Parks et al. 1994)。凝血酶是一種廣泛用于切割標簽的蛋白酶。切割可在20到37℃之間切割0.3到16小時。與腸激酶相反，Xa因子和凝血酶切割后，在目標蛋白C末端增加了兩個氨基酸。凝血酶最佳的切割位點是X4-X3-P-R[K]-X1'-X2',這里X4 和 X3 是疏水氨基酸而X1'和 X2'是非酸性氨基酸 (Chang

1985; Chang et al.1985; Haun 和 Moos 1992)。一些經常使用的識別位點是L-V-P-R-G-S,L-V-P-R-G-F,和MY-P-R-G-N在X4-X3-P-R-G-X2'之間切割比在X4-X3-P-K-L-X2'更有效。其他識別位點是 X2-R[K]-X1', 這里X2 或者 X1'是甘氨酸。例如A-R-G和G-K-A,這里切割發生在第二個殘基后。在凝血酶切割位點和N末端標簽之間插入五個甘氨酸殘基可改善切割（Guan 和 Dixon1991）。 通過這一“甘氨酸連接肽”只需較少酶量就可達到完全切割，而且也可以避免可能發生的錯誤切割。有效的消化緩沖液是純的Tris緩沖液，pH8.0。在緩沖液中存在的NaCl具有抑制作用(Haun and Moos 1992)。凝血酶可從切割產物中用p-氨基瓊脂糖親和純化，或者supero-12 FPLC 柱凝膠過濾 (Yu et al.1995)或者苯甲脒瓊脂糖移去。在標簽和目標蛋白之間的Xa因子識別位點可作為有效的工具完全去除N末端的親和標簽。Xa因子在四氨基酸肽I-E[D]-G-RX1的羧基切割(Nagai和Thogerson 1984), 這里X1可以是除了精氨酸和脯氨酸以外的其他氨基酸。切割可以在4到25℃之間進行。絕大多數Xa因子的分子量大約43 kDa,由兩個二硫鍵連接的多肽組成，一條27 kDa，一條 16 kDa。在 SDS-PAGE,還原的肽鏈具有30 kDa 和20 kDa的表觀分子量。 通過位點專一的蛋白酶如Xa因子切除標簽有時候是無效的，有Xa因子切割非專一的報導（Ko et al. 1994）。原因可能是融合蛋白的不溶性或者變性劑的存在。可通過引入5個氨基酸的多聚甘氨酸區域來增加切割(Rodriguez 和 Carrasco 1995)。丹磺酰氯-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸－氯甲基酮在室溫下1分鐘內可使Xa因子活性不可逆失活95％。雖然由于切割需要更長的孵化時間而且效率較低而使Xa因子越來越少使用，但仍有使用Xa因子的成功報導

(Pryor 和 Leiting 1997)。

表4 不同X1氨基酸殘基的腸激酶切割情況（通過分光光度法測定， Hosfield 和 Lu 1999）。具有序列....-的GST-鈣調蛋白融合蛋白用于檢測；5mg蛋白質加0.2U腸激酶在37℃下切割16小時。

X1位置的氨基酸 切割效率（％）

丙氨酸 88

甲硫氨酸 86

賴氨酸 85

亮氨酸 85

天冬酰胺 85

苯丙氨酸 85

異亮氨酸 84

天冬氨酸 84

谷氨酸 80

谷氨酰胺 79

纈氨酸 79

精氨酸 78

蘇氨酸 78

酪氨酸 78

組氨酸 76

絲氨酸 76

半胱氨酸 74

甘氨酸 74

色氨酸 67

脯氨酸 61

結論

親和標簽在蛋白質純化過程中時很重要的，可以有助于穩定蛋白質并提高其溶解性。親和層析通常可以達到90－99％的純度。純化系統的選擇取決于蛋白質本身及其進一步的應用。有時候融合蛋白由于其標簽沒有暴露到表面而不能加以純化。在變性條件下或者將標簽置于蛋白質的另一個末端可以解決這個問題。在許多情況下，第二親和標簽用于第二步親和層析以增加純度。(Pryor 和 Leiting 1997; Schioth et al. 1996)。作為選擇，一個標簽用于純化而另一個用于檢測 (Vaughan et al. 1996; Lu et al. 1997)。如果兩個不同的標簽放在不同的末端，則全長產物可通過兩步親和層析得到(Ostermeier et al. 1995; Sun 和 Budde 1995)。多個標簽也是可能的，每一個標簽用于特定的用途。多個標簽還可以連續多步純化達到高純度。這些高度純化的蛋白質使得檢測蛋白質之間的相互作用成為可能。結合的蛋白質可以通過質譜加以確認 (Honey et al.2001) 。一個特殊的多個標簽用于串聯親和層析(TAP; Rigaut et al. 1999;

Puig et al. 2001) 。它由目標蛋白質，鈣調蛋白結合肽，TEV蛋白酶切割位點，及用于固定化的蛋白A組成。TAP標簽可以快速純化特定的化合物。這一過程的用途類似于酵母雙雜交篩選(Fromont-Racine et al. 1997) 。TAP標簽可以作為蛋白質組開發的工具 (Gavin et al. 2002) 。這一方法已經在酵母中獲得證實但也可以用于其他細胞或微生物。許多對于其結合擔體具有高親和力的標簽可以作為有用的工具在表面固定化肽類或蛋白質。有生物活性蛋白質的固定化對于研究和工業應用來說都是重要的。此外，親和標簽技術的重要性將增加其在肽類/蛋白質芯片設計，高通量純化，肽類/蛋白質庫，大規模生產系統以及藥物釋放策略中的應用。

致謝 作者感謝A. Steinb_chel教授給予的大力支持，以及 F. Mayer教授在準備該文稿時的建議。

參考文獻（略）

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