GST融合蛋白的純化步驟

2023年12月12日發(作者：涉稅)

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GST融合蛋白的純化步驟

一、制取細胞的裂解物：

1.每100ml培養物的細胞沉淀懸于4ml PBS緩沖液;

2.加入溶菌酶至最終濃度1mg/ml，冰上或冷藏放置30min;

3.用針筒將10ml0.2%TritonX-100強行注入細胞裂解物中，劇烈震動數次混勻；

4.加入DNa和RNa至終濃度5ug/ml,4℃震動并溫育10min;

5.4℃3000g(5000r/min)離心30min;

6.上清轉移到一只新試管，加入DTT至終濃度為1mmol/L;

二、純化GST融合蛋白：

1.細胞裂解物與50%谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂勻漿混合，每100ml細胞培養物加2ml樹脂，于室溫下輕搖30min;

2.混合物于4℃以500g(2100r/min)離心5min,小心去掉上清并留樣少許進行SDS-PAGE;

3.沉淀中加入10倍標準體積的PBS,顛倒離心管數次混勻，洗去未與樹脂結合的蛋白；

4.4℃以500g(2100r/min)離心5min,小心去掉上清并留樣少許進行SDS-PAGE;

5.重復步驟3和4兩次；

6.結合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脫緩沖液洗脫，也可用凝血酶，腸激酶或Xa因子切割，釋放靶蛋白；

三、用谷胱甘肽洗脫洗脫融合蛋白：

1.沉淀中加入1倍柱床體積的谷胱甘肽洗脫緩沖液，室溫輕輕攪動10min,洗脫樹脂上結合的蛋白；

2.4℃以500g(2100r/min)離心5min,上清移至新管中;

3.重復步驟a和b兩次，合并3次的上清；

四、蛋白酶解從結合的GST融合蛋白上回收靶細胞：

1.在結合了融合蛋白的樹脂中加入凝血酶，腸激酶或Xa因子。每毫升樹脂加入50單位1mlPBS的蛋白酶，顛倒離心管數次混勻，室溫下震蕩2～16h,用小規模實驗確定精確時間；

2.4℃以500g(2100r/min)離心5min,上清小心移至新管中;

3.10%SDS-PAGE分析每一步（細胞抽提，洗滌和洗脫）樣品的蛋白質組成。

五、谷胱甘肽瓊脂糖樹脂的處理：

1.輕輕顛倒盛有谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂的容器，將樹脂混成勻漿；

2.取部分勻漿放入15ml聚丙烯管（每100ml細菌培養物需要2ml勻漿）；

3.4℃以500g(2100r/min)離心5min,小心去掉上清;

4.在樹脂中加入10倍柱床體積的冷的PBS,顛倒數次，混合勻漿，4℃以500g(2100r/min)離心5min,小心去掉上清；

5.每毫升樹脂加入1ml冷的PBS，制成50%勻漿，顛倒數次，懸浮冰上放置待用。

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