伯樂PDS-1000 臺式基因槍培訓文件

2023年12月14日發(作者：楊絳的名言名句)

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PDS-1000臺式基因槍培訓

一．基本用途：PDS-1000臺式基因槍采用高壓氦氣作為動力的粒子轟擊技術將包埋DNA、大小約為0.6-1.6μm的微載體（微載體與亞細胞器的大小相當，一般是鎢粉或金粉）加速到所需要的速度，從而將將外源分子導入細胞內，以達到轉染的效果。該種方法可以對廣泛的生物樣品進行轉染，如細菌、真菌、昆蟲、植物以及各種動植物細胞等。與顯微操作法相比，采用“基因槍”進行轉染不僅操作更加簡便、快速，而且適用于瞬時轉染與穩定轉染2種常用轉染方法。

二．基本原理介紹：PDS-1000臺式基因槍采用高壓氦氣作為動力（由破裂盤，rupture disks控制釋放）將含有DNA等外源分子（如DNA等）包埋的微載體（Microcarries）的載體膜（Macrocarries）加速，載體膜被終止屏（Stopping Screens）阻擋后微載體以很高的速度穿透細胞從而達到將外源分子導入細胞內部的目的。轉染的效果取決于微載體的速度，而微載體的速度又取決于如下幾個因素：

1． 氦氣的壓力，取決于不同壓力的破裂盤（一共有9種規格） 2． 基因槍腔體內的真空度

3． 破裂盤和載體膜之間的距離（A）

4． 載體膜和終止屏之間的距離（B）

5． 終止屏和樣品架即靶細胞之間的距離（C）

三．PDS-1000臺式基因槍安裝前的準備（安裝前需用戶自備）

1． 交流變壓器，具體參數：220V轉100V；功率大于500W

2． 氦氣瓶，具體參數：氦氣純度99.995~99.999%；氣瓶壓力2000~2600 psi

3． 負壓真空泵，具體參數：油式負壓泵；流量90~150升/分鐘；預留英制4分負壓出口轉接頭；喉箍

四．PDS-1000臺式基因槍操作培訓前的準備

1． 常規試劑：70%異丙醇、70%乙醇、100%乙醇、50%甘油、2.5M CaCl2、0.1M 亞精胺（組織培養級）、蒸餾水等

2． 常用儀器及耗材：60mm組織培養皿、濾紙、1.5ml離心管、離心機、渦旋震蕩器、微量移液器等

3． 基因槍操作專用耗材：破裂盤（Rupture Disks）、載體膜（Macrocarries）、終止屏（Stopping Screens）、微載體（Microcarries） 五．PDS-1000臺式基因槍操作快速指南（在使用基因槍操作前，建議首先不使用微載體和，測試基因槍的氣體通路一切正常后再進行實驗）

靶細胞進行一次“dry run”轟擊前的準備工作

1． 實驗前清洗與滅菌（高壓蒸汽滅菌）處理：破裂盤固定帽、微載體組件、載體膜及載體膜支架、終止屏

2． 采用70%乙醇對PDS-1000臺式基因槍腔體進行滅菌處理并晾干。

注意：不要對腔體進行高壓蒸氣或加熱等滅菌處理，這樣會毀壞PDS-1000臺式基因槍

3． 洗滌微載體并儲存于50%的甘油，具體洗滌步驟如下（按下面步驟得到的微載體可進行120次轟擊實驗，每次轟擊使用約500ug的微載體）

a） 稱取30mg微載體，將其放入1.5ml的離心管內

b） 在離心管內加入1ml 70%乙醇

c） 在渦旋混合器上充分震蕩3~5分鐘

d） 震蕩結束后靜置15分鐘

e） 將上述含有微載體的70%乙醇溶液離心約5秒鐘，棄上清

f） 在得到的微載體沉淀中加入1ml蒸餾水 g） 充分震蕩1分鐘

h） 震蕩結束后靜置1分鐘

i） 將上述含有微載體的水溶液大致離心后棄上清，再重復f~i的步驟2次

j） 在得到的微載體沉淀中加入500ul經滅菌的50%甘油（如忽略上述洗滌步驟中的損耗，微載體的濃度為60mg/ml）

注意：a）上述制備得到的微載體甘油溶液在室溫下可保存2周；b）如為鎢粉載體，建議在-20°C條件下儲存避免氧化，而金粉載體可在4°C或室溫下儲存

4． 在實驗的當天用外源DNA分子包埋微載體，具體包埋步驟如下（按下面步驟得到的微載體可進行6次轟擊實驗，每次轟擊使用約500ug的微載體）

a） 從上述微載體儲存溶液中吸取50ul（3mg）的微載體加入1.5ml的離心管內

注意：從微載體儲存溶液中吸取微載體時，需將微載體儲存管放置在渦旋混合器上持續地、充分的震蕩，因為這樣才能避免微載體之間形成聚合體從而使DNA均勻地包埋在微載體的表面

b） 加入5ul DNA（1ug/ul）

c） 加入50ul 2.5M CaCl2

d） 加入20ul 0.1M 亞精胺，持續震蕩2~3分鐘

e） 震蕩結束后靜置1分鐘后離心約2秒鐘，棄上清

f） 在得到的沉淀中加入140ul 70%乙醇（HPLC級或分光光度計級），離心棄上清

g） 在得到的沉淀中加入140ul 100%乙醇，離心棄上清

h） 在得到的沉淀中加入48ul 100%乙醇，輕輕地拍打離心管管壁數次后，在低速的混合器上充分震蕩2~3秒鐘

5． 將包埋得到的微載體放置于載體膜（Macrocarrier）及載體膜支架（Macrocarrier

Holder）。首先準備一個帶蓋的經滅菌處理的60mm組織培養皿，在其底部鋪上一層CaCl2作為干燥劑，并在CaCl2上放一張濾紙；然后將載體膜及載體膜支架放在濾紙上，不銹鋼的載體膜支架與濾紙接觸而載體膜向上；最后用微量移液器吸取6ul（約500ug的微載體）經包埋處理的微載體水平地涂在載體膜中央直徑約1cm的范圍內，完成鋪涂后立刻蓋上組織培養皿的蓋子約10分鐘，使乙醇揮發。（具體操作如下圖所示）

注意：a)為確保實驗結果建議使用最新包埋好的微載體；b)上述操作需在一個平穩的工作臺上進行以避免震動引起微載體互相凝結；c)在吸取微載體時還需將經包埋處理的微載體儲存液放置在渦旋震蕩器上；d)上述操作制備得到的載體膜及載體膜支架在2小時后即不能使用，需重新制備

6． 將破裂盤放置到位。首先用經過滅菌處理的鑷子取出破裂盤并在70%異丙醇液體內輕蘸幾下進行滅菌；然后將上述處于濕潤狀態的破裂盤放置在破裂盤固定帽內；最后將上述含有破裂盤的破裂盤固定帽連接到基因槍腔體內的氦氣氣體加速管（gas

acceleration tube）上，并用扳手擰緊。（具體操作如下圖所示）

注意：a)取破裂盤必須使用經過滅菌處理的鑷子，因為油脂、指紋以及手套上的粉末都會造成破裂盤與破裂盤固定帽之間不能緊密結合從而導致漏氣；b)在對破裂盤進行滅菌處理時不要將破裂盤長時間的浸在70%異丙醇內，否則會造成破裂盤的脫層；c)當破裂盤固定帽內沒有放入破裂盤時不要與氦氣氣體加速管擰緊，避免二者的金屬表面由于刮擦而引起漏氣；d）不能對破裂盤進行高壓蒸汽滅菌

7． 根據具體的實驗條件調節破裂盤和載體膜之間的位置，最后放置終止屏

注意：在進行轟擊前確認在微載體組件內放置了終止屏，否則靶細胞會由于高速的微載體和載體膜而受到損傷

8． 檢查氦氣瓶的壓力，氦氣瓶的壓力需要超過具體破裂盤對應壓力200 psi（如使用900 psi規格的破裂盤，那么氦氣瓶的指示壓力必須為1100 psi）

9． 將待轉染的靶細胞或組織放在臺式基因槍腔體內特定的位置上，關門

轟擊的流程

1． 確認PDS-1000臺式基因槍電源線連接完好，按下紅色的“Power Switch ON/OFF”鍵開機

2． 按下“Vac/Vent/Hold Switch”鍵設置在VAC檔位對臺式基因槍腔體抽真空，并維持在特定的真空度水平上（真空度至少為5英寸高的水銀汞柱），達到最低的真空度時最右面的“Fire Switch”鍵的指示燈會閃爍。當達到設定的真空度時，迅速地將“Vac/Vent/Hold Switch”鍵設置在HOLD檔位維持該真空度

3． 按住“Fire Switch”鍵直到破裂盤破裂、氦氣壓力表顯示為零才釋放“Fire”鍵（具體操作如下圖所示）

注意：a)在破裂盤破裂前釋放“Fire Switch”鍵實驗失敗；b)在破裂盤破裂后長時間不釋放“Fire Switch”鍵導致氦氣的浪費；c)破裂盤破裂時會有輕微的響聲，此時觀察臺式基因槍上方的氦氣壓力表就可以知道破裂盤破裂所需的具體壓力；d)當壓力達到設定值的90%左右時，破裂盤破裂所需的時間大致為11~13秒

轟擊后儀器的維護

1． 按下“Vac/Vent/Hold Switch”鍵設置在VENT檔位停止對臺式基因槍腔體抽真空

2． 當臺式基因槍真空度顯示為0時打開腔體門將實驗細胞或組織從腔體內取出

3． 將微載體組件（microcarry launch asmbly）拿下，丟棄載體膜及終止屏

4． 取下破裂盤固定帽（rupture disks retaining cap）上使用后的破裂盤（rupture disks）

5． 關閉氦氣瓶閥門

六．PDS-1000臺式基因槍實驗優化指南

1． 基因槍腔體內的真空度：對于植物或其他微生物細胞建議為28~29英寸高的水銀汞柱，而對于哺乳類細胞則一般采取~15英寸高的水銀汞柱

2． 氦氣壓力/破裂盤（450~2200 psi）的選擇：一般而言破裂盤的壓力越高，那么微載體的速度和穿透力也越強，但同時可能對細胞也可能造成損傷。建議在能取得良好轉染效果情況下，選用壓力最小的破裂盤。對于不同的樣品建議如下。

3． 破裂盤和載體膜之間的距離，距離越小微載體的速度就越快。PDS-1000提供3種破裂盤和載體膜之間的距離共選擇，分別為1/8’’，1/4’’，3/8’’。建議采用1/4’’為起點來進行實驗參數的優化

4． 載體膜和終止屏之間的距離

5． 終止屏和樣品架即靶細胞之間的距離

6． 微載體種類的選擇：鎢粉（共5種規格）的優點是價格相對便宜，不足之處在于：對某些細胞可能具有毒性作用；比較容易氧化導致DNA包埋的效果不理想；顆粒不規則，同一規格的顆粒大小差異較大，不利于實驗的優化。金粉（共3種規格）的優點是顆粒更接近球型，且同一規格的顆粒大小很一致；是一種惰性介質，不足之處在于：在進行DNA包埋反復洗滌、沉淀時的穩定性不如鎢粉

7． 微載體的大小，微載體越大，那么其速度就越快，對細胞的穿透力也越強。

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