用牛肉膏和蛋白胨固體培養基進行大腸桿菌的純化培養

2024年3月6日發(作者：三原色三間色)

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用牛肉膏和蛋白胨固體培養基進行大腸桿菌的純化培養，包括兩大階段：

⑴制備牛肉高蛋白胨固體培養基

①計算：根據牛肉膏蛋白胨培養基配方的比例，計算配制100ml培養基中各種成分的用量。

②稱量：準確稱取各種成分。

③溶化：將稱好的牛肉膏連同稱量紙一同放入燒杯，加入少量的水，加熱；

當牛肉膏溶化并與稱量紙分離后，用玻璃棒取出稱量紙；

箱燒杯中加入稱量好的蛋白胨和氯化鈉，玻璃棒攪拌，使其溶解；

加入瓊脂，加熱使其熔化。持續攪拌防止糊底導致燒杯破裂；

當瓊脂完全熔化，補加自來水至100ml。

④滅菌：將配置好的培養基轉移到錐形瓶中，加棉塞，包上牛皮紙，用皮筋勒緊，放入高壓滅菌鍋，壓力為100KPa，溫度為121℃，滅菌15～30min。

將培養皿用幾層舊報紙包緊，5～8套培養皿一包，放入干熱滅菌箱，160～170℃滅菌2h。

⑤倒平板：待培養基冷卻至50℃左右時，在酒精燈火焰附近倒平板。

倒平板操作步驟：

A．將滅過菌的培養皿放在火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養基的錐形瓶，左手拔出棉塞；

B．右手拿錐形瓶，使瓶口迅速通過火焰；

C．用左手的拇指和食指將培養皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培養基（約10～20ml）倒入培養皿，左手立即蓋上培養皿的皿蓋；

D．等待平板冷卻凝固后，將平板倒過來放置，使皿蓋在下、皿底在上。

小資料：牛肉膏蛋白胨固體培養基配方

成分

牛肉膏

蛋白胨

NaCl

瓊脂

含量

5.0g

10.0g

5.0g

20.0g

提供的主要營養

碳源、磷酸鹽、維生素

氮源、維生素

無機鹽

承載物

⑵純化大腸桿菌

①微生物接種的方法最常用的是平板劃線法和稀釋涂布法；還包括斜面接種、穿刺接種等方法。盡管操作方法各有不同，其核心都是防止雜菌污染，保證培養物的純度。

②平板劃線法就是通過接種環在瓊脂固體培養基表面連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基的表面。

（在數次劃線后，可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體——菌落。）

平板劃線法操作步驟：

A．將接種環放在火焰上灼燒，直到接種環燒紅；

B．在火焰胖冷卻接種環，并打開棉塞；

C．將試管口通過火焰；

D．將已經冷卻的接種環伸入菌液中，沾取一環菌液；

E．將試管口通過火焰，并塞上棉塞。

F．左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環迅速伸入平板內，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。（注意：不要劃破培養基）

G．灼燒接種環，待其冷卻后，從第一區域劃線的末端開始往第二區域內劃線，重復以上操作，在第三、四、五區域內劃線。（注意：不要將最后一區的劃線與第一區相連）

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H．將平板倒置，放入培養箱中培養。

③什么是稀釋涂布法？

將菌液經過一系列的梯度稀釋，然后將不同濃度的菌液分別涂布到培養基的表面進行培養。

（在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物被分散成單個細胞，從而能在培養基表面形成單個的菌落）

稀釋涂布法操作步驟：

A．將分別盛有9ml水的6支試管滅菌，并按10-1～10-6的順序進行編號；

B．用移液管吸取1ml培養的菌液，注入10-1倍稀釋液的試管中。

用手指輕壓移液管的橡皮，吹吸三次使菌液與水充分混合。

C．從10-1倍稀釋液的試管中吸取1ml培養的菌液，注入10-2倍稀釋液的試管中。

重讀進行，以此類推，直到完成最后一支試管的稀釋。

注意：移液管需要經過滅菌。操作時，試管口和移液管應在離火焰1～2cm處。

涂布平板操作步驟：

A．將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中；

B．取少量菌液（不超過0.1ml），滴加到培養基表面；

C．將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃盡后，冷卻8～10s；

D．用涂布器將菌液均勻地涂布在培養基表面。

涂布時可轉動培養皿，使涂布均勻。

注意：將涂布器末端浸在盛有體積分數為70%的酒精的燒杯中，取出時，要讓多于的酒精在燒杯中滴盡，然后將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。

操作中一定要注意防火！不要將過熱的涂布器放在盛有酒精的燒杯中，以免引燃其中的酒精。

將接種后的培養基和一個未接種的培養基都放入37℃恒溫箱中，培養12h和24h后，分別觀察并記錄結果。

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