硫酸銨分級沉淀原理及實驗方案

2024年3月15日發(作者：單薄)

一， 基本原理

硫酸銨沉淀法可用于從大量粗制劑中濃縮和部分純化蛋白質。用此方法可以將主要的免

疫球從樣品中分離，是免疫球蛋白分離的常用方法。高濃度的鹽離子在蛋白質溶液中可與蛋

白質競爭水分子，從而破壞蛋白質表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液中沉淀出來。

各種蛋白質的溶解度不同，因而可利用不同濃度的鹽溶液來沉淀不同的蛋白質。這種方法稱

之為鹽析。鹽濃度通常用飽和度來表示。硫酸銨因其溶解度大，溫度系數小和不易使蛋白變

性而應用最為廣范。

二， 試劑及儀器

1 . 組織培養上清液、血清樣品或腹水等

2. 硫酸銨（ NH 4 ） SO 4

3. 飽和硫酸銨溶液（ SAS ）

4. 蒸餾水

5. PBS( 含 0.2g /L 疊氮鈉 )

6. 透析袋

7. 超速離心機

8. pH 計

9. 磁力攪拌器

三， 操作步驟

以腹水或組織培養上清液為例來介紹抗體的硫酸銨沉淀。各種不同的免疫球蛋白鹽析所需硫

酸 銨的飽和度也不完全相同。通常用來分離抗體的硫酸銨飽和度為 33% — 50% 。

（一）配制飽和硫酸銨溶液（ SAS ）

1.將 767g （ NH 4 ） 2 SO 4 邊攪拌邊慢慢加到 1 升 蒸餾水中。用氨水或硫酸調到硫酸

pH7.0 。此即飽和度為 100% 的硫酸銨溶液（ 4.1 mol/L, 25 ° C ）.

2.其它不同飽和度銨溶液的配制

（二）沉淀

1.樣品（如腹水） 20 000 ′ g 離心 30 min ，除去細胞碎片；

2.保留上清液并測量體積；

3.邊攪拌邊慢慢加入等體積的 SAS 到上清液中，終濃度為 1 ： 1 （

4.將溶液放在磁力攪拌器上攪拌 6 小時或攪拌過夜（ 4 ° C ），使蛋白質充分沉淀。

（三）透析

1.蛋白質溶液 10 000 ′ g 離心 30 min （ 4 ° C ）。棄上清保留沉淀；

2.將沉淀溶于少量（ 10-20ml ） PBS -0.2g /L 疊氮鈉中。沉淀溶解后放入透析袋對

PBS -0.2g /L 疊氮鈉透析 24-48 小時（ 4 ° C ），每隔 3-6 小時換透析緩沖液一次，以徹

底除去硫酸氨；

3.透析液離心，測定上清液中蛋白質含量。

四，應用提示

（一） 先用較低濃度的硫酸氨預沉淀，除去樣品中的雜蛋白。

1.邊攪拌邊慢慢加 SAS 到樣品溶液中，使濃度為 0.5:1 (v/v) ；

2.將溶液放在磁力攪拌器上攪拌 6 小時 或過夜（ 4 ° C ）；3.3000 ′ g 離心 30 min （ 4 °

C ），保留上清液；上清液再加 SAS 到 0.5:1(v/v) ，再次離心得到沉淀。將沉淀溶于 PBS ，

同前透析，除去硫酸氨；

4.上清液再加 SAS 到 0.5:1 (v/v) ，再次離心得到沉淀。將沉淀溶于 PBS ，同前透析，除

去硫酸氨；

5.雜蛋白與欲純化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差別很大時，用預沉淀除雜蛋白是非常有效

（二）為避免體積過大，可用固體硫酸氨進行鹽析（硫酸氨用量參考表 1 ）；硫酸氨沉淀

法與層析 技術結合使用，可得到更進一步純化的抗體。

今天作的實驗是利用硫酸銨沉淀蛋白質，從之前作過的經驗知道，這一個步驟是有名的煩，

要慢慢用敲的把硫酸銨緩緩的加入蛋白質溶液中。

相關的原理可以在莊榮輝學習網站中找到，與鹽溶剛好相反，在蛋白質溶液中加入硫酸銨，

會使得蛋白質的溶解度下降，因而沉淀出來。因為硫酸銨所解離的離子容很大，所帶的電子

數也多(NH4+, SO42-)，因此當其溶入水中時，會吸引大量水分子與這些離子水合。

蛋白質分子表面多少有一些較不具極性的區域，水分子會在這些非極性區的表面聚集，形

成類似『水籠』的構造(請見下圖)，以便把蛋白質溶入水中。一旦蛋白質溶液加入硫酸銨，

后者吸引了大量水分子，使水籠無法有效隔離蛋白質的非極性區，造成這些非極性區之間的

吸引，因而沉淀下來。因此，分子表面上若有越多的非極性區域，就越容易用硫酸銨沉淀下

來。

在計算所添加的硫酸銨的重量方面，找到了一個不錯的網站——硫酸銨計算機

這個網頁上可以靠著輸入實驗溫度、溶液體積、想要到達的百分濃度以及初始的百分濃度這

四個數值，就可以得到需要添加的硫酸銨克數，以及在加入固體硫酸銨后所增加的體積，算

是一個很不錯的網站。

此外另一個比較值得提的，是我有用兩種方式加入硫酸銨，第一種是固體的硫酸銨模碎加入，

另一種是將硫酸銨溶成飽和溶液再加入，各有各的優缺點，比較如下：

1.造成蛋白質變質的程度：固體的硫酸銨>硫酸銨飽和溶液

利用硫酸銨飽和溶液真的超棒，滴入的速度可以很快而不造成變質(沒試過用倒入的)。 不

像固體的硫酸銨只能磨碎慢慢加入，速度一快蛋白質就壞了(溶液有致密的白色氣泡產生)。

2.操作的容易度： 硫酸銨飽和溶液>>固體的硫酸銨

固體硫酸銨最大的缺點就是操作不容易，要一直敲敲敲又不能太快，所以當你要溶解的蛋白

質很多時，這是很累的步驟。然而硫酸銨飽和溶液比較麻煩只有在配制部分，要先加熱讓它

飽合后，回到操作溫度讓它過飽和，最后用濾紙把硫酸銨結晶去掉。

3.蛋白質溶液的體積放大程度 硫酸銨飽和溶液>>固體的硫酸銨

這是使用硫酸銨飽和溶液最頭痛的部分，舉例來說，要讓100 ml的硫酸銨百分比從0%到

25%， 如果是加入固體的硫酸銨，只會讓溶液從100 ml變成107 ml左右，但若是加入硫酸

銨飽和溶液，會讓溶液變成125 ml！而且若是要提高到50%，須加等量的硫酸銨飽和溶液，

所以會讓蛋白質溶液從100 ml變成200 ml。

因此在加入硫酸銨時，若是低百分濃度可以利用硫酸銨飽和溶液，然而如果是高百分濃度的，

除非不在意蛋白質溶液體積的放大(反正都要離心離下來)，否則還是用固體硫酸銨來的好。

所以今天從0%拉到25%及從25%拉到50%時，都是利用硫酸銨飽和溶液，但是當要從50%

拉到75%時，我選擇利用固體硫酸銨，因為如果用硫酸銨飽和溶液， 離心機無法離那么多

的溶液體積。