甾醇生物合成中的關鍵酶—環氧角鯊烯環化酶的分子生物學研究_

2024年4月1日發(作者：滿腔熱忱的意思)

甾醇生物合成中的關鍵酶—環氧角鯊烯環化酶的分子生物學研究

摘 要：植物體中環氧角鯊烯環化酶催化2，3－環氧角鯊烯形成一系列三萜烯，為甾

醇和三萜化合物的生物合成提供前體，這一催化反應被認為是甾醇和三萜化合物生物合成

分支形成的關鍵位點，綜述了甾醇和三萜化合物生物合成中的關鍵酶——環氧角鯊烯環化

酶(OSCs)家族的生物學功能，基因克隆與屬性，酶的細胞定位與酶活的表達調控等分子生

物學研究進展。

關鍵詞：環氧角鯊烯環化酶(OSCs)；甾醇；三萜化合物

植物體中許多次生代謝物產生于乙酸、莽草酸及甲羥戊酸等少數前體，在甲羥戊酸為

前體的異戊二烯代謝途徑中，又分別以異戊烯焦磷酸、牻牛兒苗基焦磷酸、法尼基焦磷酸、

牻牛兒苗、牻牛兒苗基焦磷酸為底物，形成一系列次級代謝分支，兩個法尼基焦磷酸縮合

形成的三萜角鯊烯被轉化成2，3環氧角鯊烯(os)，接下來進行的2，3環氧角鯊烯(OS)環

化是三萜化合物和甾醇生物合成的關鍵性第一步反應，所以，在此形成的甾醇(類固醇)生

成支路和五環三萜(烯)生成支路成為基礎代謝和次生代謝的分支點(圖1)。

催化2，3環氧角鯊烯環化形成一系列中間產物的酶，在酶促生物化學研究和酶工業

生產上都有重要意義，真核生物中，2，3氧化角鯊烯被環化形成兩種不同的三萜化合物：

非光合生物中(脊椎動物、真菌)由羊毛固醇合成酶(LS)催化形成羊毛固醇，光合生物中則由

環阿屯醇合成酶(CS)催化形成環阿屯醇，兩者都是甾醇的合成前體．另外，2，3氧化角鯊

烯(OS)在高等植物中還可以環化形成其他結構、功能各異的三萜化合物：齊墩果烷、烏斯

烷、羽扇豆烷、達瑪烷、木栓烷(friedelane)等，在OSCs分離、純化，基因的克隆及表達

分析上取得的新進展，使人們對酶結構與2，3氧化角鯊烯環化機理有了更深入的了解。

1 環氧角鯊烯環化酶(OSCs)家族

1．1 甾醇生物合成中的OSCs

甾醇生物合成的前體羊毛固醇和環阿屯醇的形成起始于環氧角鯊烯椅-船-椅-船構象

的排列，產生中間體C-20原甾醇陽離子，接著這一中間體進行骨架重組形成羊毛固醇框

架或環阿屯醇框架(圖1)，上述環化反應分別由羊毛固醇合成酶(LS)和環阿屯醇合成酶(CS)

催化完成。

通常純化足夠量的OSCs來進行氨基酸序列分析或生產抗體是很困難的，植物中環阿

屯醇合成酶不僅量很少，而且很難獲得具有生物活性的溶解酶．另外，植物中環氧角鯊烯

經環化后能產生除環阿屯醇外一種或多種化合物，實驗中無法用粗勻漿液來作為單一酶活

的研究，近年來，通過對環阿屯醇合成酶的克隆體進行異源表達為解決這一難題帶來了希

望，但后來的研究發現環阿屯醇在酵母中表達量很少，使得環阿屯醇合成酶基因很難通過

互補突變體的方法進行克隆，而植物阿屯醇合成酶代謝突變體又不易獲得，一種解決辦法

就是采用體外飼喂氚標記的氧化角鯊烯底物對酵母提取液中環阿屯醇酶活力進行檢測，另

一種方法是用接有組成型酵母啟動子的植物cDNA文庫轉化突變體酵母(SMY1)，然后用

TLC或HPLC分析環阿屯醇酶的活性，還可以通過合成類似物的方法來仔細研究它們的分

子細節，哺乳動物和真菌中，羊毛甾醇合成酶較易獲得，動物肝臟和面包酵母勻漿物中都

含有豐富的的羊毛甾醇合成酶，可以直接用于酶促反應，而且其中只含有一種變位酶，酶

促反應中的產物也是唯一的，因此研究較為深入。

隨著人們對LS、CS酶序列了解的日益增多，發現這些氨基酸序列中存在極度保守的

部分，酵母、人類、老鼠的羊毛固醇合成酶(LS)的cDNA序列就是根據這些保守序列設計

簡并引物，通過PCR克隆出來的，亞麻(m)中環阿屯醇合成酶(CS)cDNA的克隆也

是如此，cDNA的功能可以通過在LS－缺陷型酵母中來表達確定。

1．2 三萜生物合成中的OSCs

環氧角鯊烯通過椅-椅-椅-船式構象變化，則形成四環素達瑪正離子中間體，在環氧角

鯊烯達瑪二烯醇合成酶催化下，該正離子生成達瑪烷型三萜，四環素達瑪正離子還可進一

步轉化形成羽扇豆正離子或齊墩果正離子，再由它們形成羽扇豆、β-香樹素和α-香樹素，

之后被修飾成五環三萜，三萜合成酶怎樣催化形成不同產物的機制還不甚了解。

烏斯烷型三萜和齊墩果烷型三萜是兩種主要的三萜骨架形式，那么，β－香樹素和α

－香樹素形成的機制就成為首要解決的問題，實際上，環化的差異主要出現在C-19oleanyl

正離子階段，β－香樹素和α－香樹素合成酶活性位點的保守氨基酸殘基可能與C-19

oleanyl正離子形成有關，其中特異氨基酸殘基可能決定該正離子的轉移特征，β－香樹素

和口，香樹素合成酶的克隆有助于對這兩個分支途徑的理解。

2，3環氧角鯊烯環化形成不同的三萜化合物是由單一或不同的環化酶作用產生，還是

環化作用之后一些因子修飾而成?豌豆幼苗葉中β－香樹素合成酶和環阿屯醇合成酶的活

性變化與固醇和三萜化合物含量的變化一致，說明這兩種酶是不同的蛋白，隨著人參、豌

豆、橄欖、蒲公英、擬南芥等雙子葉植物的β－香樹素合成酶、羽扇豆合成酶和其它一些

多功能三萜合成酶基因的克隆和序列分析，發現三萜合成酶在結構上與其它的環氧角鯊烯

環化酶具有相似性，應屬環氧角鯊烯環化酶家族中的獨立分支，由2，3－環氧角鯊烯環化

可產生90多種不同碳架的三萜化合物，而目前只發現三類三萜合成酶：β－香樹素合成酶、

羽扇豆醇合成酶、混合型香樹素合成酶，自然界是否也存在相應數量的三萜合成酶或者是

否存在多功能酶已為許多研究者所關注。

2 環氧角鯊烯環化酶(OSCs)基因克隆

一系列物種的羊毛固醇合成酶(哺乳動物、酵母等)、環阿屯醇合成酶(擬南芥、人參、

水稻、豌豆、甘草等)、三種三萜合成酶、兩種βAS和一種羽扇豆醇合成酶的cDNA已經

報導，基因序列分析表明，在植物環氧角鯊烯環化酶中，三萜合成酶和環阿屯醇合成酶應

屬環氧角鯊烯環化酶家族中的獨立分支，Tania Huslstein-Muller等對擬南芥三萜合成

酶基因結構采用“GTX XAG規則”手工分割內含子，結果獲得了1種環阿屯醇合成酶

(ATCYC)，5種羽扇豆醇合成酶(ATLUP1-5)，和7種5環三萜合成酶(ATPEN1-7)，其中環

阿屯醇合成酶基因包含18個外顯子，羽扇豆醇合成酶(ATLUP1，2)有17個外顯子，五環

三萜合成酶(ATPEN1，2)含外顯子14個，其它3種羽扇豆醇合成酶(ATLUP3-5)和另外5

種環三萜合成酶(ATPEN3－7)也呈現出非常相似的結構，不同的亞族成員其外顯子數量變

化不大，外顯子與內含子之間間隔相似，但內含子數量變化較大，剪接方