重組人腸激酶純化方案

2023年12月12日發(作者：七寶街)

重組人腸激酶純化方案一、設計背景腸激酶是存在于哺乳動物十二指腸內的一種異源二聚體絲氨酸蛋白酶。分子質量為150ku，由1條115ku重鏈和1條35ku輕鏈組成，在pH值4.5～9.5、溫度4～45℃范圍內特異性水解蛋白底物。天然腸激酶由1條結構亞基（重鏈）和1條催化弧基（輕鏈）構成，兩者通過1個分子間二硫鍵結合，結構亞基負責將催化亞基固定在小腸刷狀緣膜上并引導它向腸腔移動，催化亞基可以特異性識別Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列并沿序列的羧基端切下，由于經BEK（即重組人腸激酶）裂解融蛋白所釋放的目的多肽具有和野生型完全一致的N-末端氨基酸序列，因而可作為蛋白表達體系中融合蛋白的切割試劑。如將胰蛋白酶原活化為胰蛋白酶，從而啟動各種酶原活化的級聯。目前化工生產一般用稀酸法提取，此法的缺點是天然的腸激酶來源有限，并且提取分離的成本高，加之天然提取的腸激酶易為其它蛋白酶污染，造成切割融合蛋白的同時又降解了目的產物。而基因工程的方法具有低成本高純度且易分離低污染的特點，因而運用基因工程的方法生產腸激酶廣為應用。二、設計依據金屬鰲合親和層析介質，又稱固定金屬離子親和色譜，其原理是利用蛋白質表面的一些氨基酸，如組氨酸能與多種過渡金屬離子如Cu"，z.n"',Ni"，co，Fe"發生特殊的相互作用，能夠吸附富含這類氨基酸的蛋白質，從而達到分離純化的目的。因此，偶聯這些金屬離子的瓊脂糖凝膠就能夠選擇性地分離出這些含有多個組氨酸的蛋白以及對金屬離子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸也能與固定金屬離子結合，但這種結合力要遠小于組氨酸殘基與金屬離子的結合力。鎳NTA親和層析介質(Ni-NTA）具有特異性好、流速快的優點，顆粒粒度均勻，粒徑小，并且鰲合鎳更穩定，能耐受更高的還原劑，物理和化學穩定性好，批次重復性好。本產品已經螯合好鎳離子，使用更方便。與大多蛋白的分離純化方法類似，重組人腸激酶（BEK）可通過硫酸銨沉淀、DEAE柱、凝膠層析和透析等方法得到純品。另外，運用組氨酸(Histidine,His)在蛋白末端進行標記，使用Nickel金屬螯合柱親和純化這種低成本高效率一步分離蛋白的方法，也正廣泛地運用到BEK的分離純化。本方案依據蛋白質與金屬離子親和的原理設計了一種使用Ni2+螯合親和層析填料純化BEK的方案。三、提取方案（一）材料、試劑與儀器設備1.材料與試劑物料名稱EDTA氫氧化鈉Ni6FF（IDA）Tris氯化鈉咪唑磷酸二氫鈉磷酸氫二鈉EDTA氫氧化鈉Ni6FF（IDA）Tris氯化鈉咪唑磷酸二氫鈉級別ARARN/AARARARARARARARN/AARARARAR生產商西隴科學西隴科學匯研生物麥克林廣東光華麥克林西隴科學西隴科學西隴科學西隴科學匯研生物麥克林廣東光華麥克林西隴科學2.儀器與耗材儀器：紫外檢測儀、層析柱（1L）、低溫離心機（湘儀離心儀器有限公司）耗材：凍存管、培養皿、量筒、槍頭、燒杯、標簽等，由珠海冀百康生物科技有限公司提供。（二）純化工藝流程圖（三）純化操作前準備工作1.層析柱裝填填料：NiFocuro6FF（IDA）原理：NiFocuro6FF（IDA）是利用Ni2+與蛋白質側鏈上的某些氨基酸(主要為組氨酸、半胱氨酸、色氨酸)相互作用而進行分離純化，適用于His標簽蛋白及與Ni2+具有相互作用的生物分子的分離純化。NiFocuro6FF（IDA）的特點：a.快速、簡單（一步純化）。b.使用范圍廣、操作簡單，適合重力柱和預裝柱（蠕動泵或者層析系統）。c.多重選擇，當Ni2+不能獲得較好的應用時，可以螯合其它的金屬離子進行使用（例如Cu2+、Zn2+、Fe2+、Co2+、Ca2+等）。備注：當螯合Ca2+時，避免使用磷酸鹽緩沖液（會形成沉淀）。體積：0.5L。層析柱：5cm×50cm。填料裝柱步驟如下：（1）取層析柱，拆卸柱頭和柱尾，注意拆卸柱頭前，需將密封閥擰松，然后緩慢將柱頭拔出。柱尾同理。（避免將柱頭拔斷）（2）將層析柱沖洗干凈，柱頭，柱尾的膜需仔細清洗，然后用純化水將層析柱潤洗幾遍（避免殘留其他填料）。（3）潤洗后先將柱尾裝上，擰緊末端的密封閥，擰上螺絲，注意擰螺絲時需兩兩相對的擰（確保擰緊且擰入的長度一致，避免底部漏液）。（4）將層析柱固定于鐵架臺上，用水平儀打好水平（防止沉裝填料時表面不平影響實驗）。（5）先將層析柱內裝入一定量的純化水，用注射器從下端出液口吸出氣泡，然后保留約1.5cm高的水（防止裝填料前干柱子）。（6）向層析柱內加入填料，不斷緩慢地沿層析柱口的邊緣加入純化水，待填料沉降高度約為層析柱的2/3，向填料上方加入純化水至于柱口持平，夾柱下方出液口（防止處理柱頭時干柱）。（7）將柱頭所連接的進液管夾在蠕動泵上，排除管路內氣泡。柱頭膜上的氣泡可用滴管吸去。（8）排去氣泡后關停蠕動泵，將柱頭緩慢裝入柱子，注意裝柱頭時需保持填料平整。（9）裝好柱頭后按照和柱尾相同的方法擰緊螺絲，擰緊頂部的密封閥。（10）裝好柱子后先用純化水低流速沖柱，沖至填料緊實后可提高流速。若是已安裝的層析柱，使用0.2MEDTA將金屬離子螯和脫去之后再使用0.5MNaOH再生，然后后掛Ni2+（0.1M硫酸鎳溶液），層析柱測定柱效合格后可重復使用。2.平衡液的配制（1）配方：50mMTris、1.6M氯化鈉、40mM咪唑ph8.50±0.02。（2）配制量：5L3洗脫液的配制（1）配方：50mMTris、1.6M氯化鈉、0.2M咪唑ph8.50±0.02。（2）配制量：2L（四）純化步驟1.樣品預處理（樣品來自珠海冀百康生物科技有限公司發酵部門發酵培養的BEK發酵液）（1）經發酵所得發酵液進行離心，7000r/min，離心2-3次，每次10min；（2）測量離心上清的體積；（3）將離心后上清進行破碎均質，均質兩到三次，每次10min；（4）均質后再次離心，取上清，測得體積，低溫保存待用；（5）樣品再上樣前需將PH值調至與平衡液一致上樣。2.純化流程（1）樣品處理：Ni6FF：樣品加10mM咪唑，調pH至8.00上樣。（2）平衡：將用平衡液將裝填好的Ni柱，用平衡液平衡2-3倍柱體積，流速為1-2CV/h，直至紫外檢測UV值到基線平穩。目的是使柱內的液體環境變為填料的吸附最優條件，使吸附力最大化，以保證產品的利用率以及后續實驗純度，避免因吸附不完全而導致實驗結果出現誤差。（3）上樣：平衡結束后按1-2CV/h流速上樣，載量為(65U/ul)/ml填料。上樣時需注意盛放樣品的容器應大小適宜防止有空氣從管路進入導致柱內有氣泡，若不慎進入氣泡，需先直接再生，而后將柱子重新拆分，清洗柱頭并重裝填料，即從頭開始實驗。（4）再平衡：用平衡液再平衡2~3倍柱體積，流速為1-2CV/h，直至紫外檢測UV值到基線平穩。平衡液需調定PH與管路內PH一致，防止因PH值不同而導致目標物不掛柱，導致實驗失敗。（5）洗脫：用平衡液和洗脫液量得各50ml將平衡液倒入與進液管相連的梯度洗脫缸中，梯度混懸儀的轉速不宜過快，應保持較均速的攪動，保證由低濃度到高濃度后，進行梯度洗脫，洗脫10CV。控制流速1-2CV/h。當出峰時開始收集，視出峰圖樣進行分段收集（一般峰頂單獨收集一個），以達到獲得收集純度最高時的濃度數據，待紫外檢測UV值降至基線時結束收集。（6）再生：洗脫結束后使用0.2MEDTA脫Ni2+，用純化水洗滌3-6CV，然后使用再生液再生2-4CV，純化水沖至中性，流速為1-2CV/h。再生后的柱子如在短時間內仍需使用，則可將柱子兩端管口夾緊，防止氣泡進入或柱子內保存液流干；如不再使用，則將柱子拆洗，填料在確認再生完全后倒回原容器中。3.注意事項（1）樣品預處理時應破碎均勻無沉淀。（2）低溫保存樣品。（3）實驗過程中需注意流速一致。（4）時刻注意紫外檢測基線。（5）記錄紫外檢測儀上的UV值。（6）記錄實驗數據如：平衡體積、上樣量及時間、再平衡體積、透過體積、洗脫時間和體積、各收集的體積和出峰體積等。（7）各收集取樣（若是分開收集需按體積比取樣的要計算好取樣量）（8）測定蛋白含量和后計算收率和純度,。4.重組人腸激酶的電泳定性分析試驗后收集的樣品（SJ）送檢電泳分析，收集品的條帶清晰，未出現拖尾現象，與標準品所示條帶位置一致，證實產物確為BEK。四、小結本設計采用Nickel金屬螯合柱親和純化法純化重組人腸激酶，此實施方案結合了前人的豐富經驗，在實際操作步驟上對純化條件加以細微改動，在整個純化過程中，每一純化步驟都非常重要。其中，由于上樣量較多，為保證上樣的條件，操作過程中再平衡時間應控制在兩倍柱體積，保證上樣掛柱。同時，對試劑的用量和上樣量，再平衡及洗脫時間合理把握，最后制得重組人腸激酶。通過Nickel金屬螯合柱親和純化這種一步分離蛋白的方法，嚴格按照設計方案步驟進行操作，并對BEK進行電泳分析，經驗證，純化所得產品與標準品的電泳圖幾乎一致，可以確定產物為重組腸激酶。五、附件材料圖1.5cm*50cm層析柱MSY圖2.紫外檢測儀（嘉鵬）和蠕動泵（琪特）SJ圖3.純化后電泳圖六、參考資料1.張向輝,譚樹華,李泰明.腸激酶特點及其基因工程的研究進展[J]藥物生物技術2005.05.16.2.張弨.重組牛腸激酶的克隆表達、純化與活性測定方法研究[D].浙江大學.2019.3.孫自勇,陳均勇,陳新園,汪晶,田鵬鵬,吳盛,劉建寧.牛腸激酶輕鏈在畢赤酵母中的分泌表達、純化和活性鑒定[J].南京大學學報(自然科學版),2004(01):41-48.4.宋曉彤.重組腸激酶包涵體的復性、純化及其新型重組子的構建[D].天津大學,2008.