融合蛋白標簽與純化

2023年12月12日發(作者：民族團結繪畫)

蛋白標簽

蛋白標簽

蛋白標簽（proteintag）是指利用DNA體外重組技術，與目的蛋白一起融合表達的一種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達、檢測、示蹤和純化等。隨著技術的不斷發展，研究人員相繼開發出了具有各種不同功能的蛋白標簽。目前，這些蛋白標簽已在基礎研究和商業化產品生產等方面得到了廣泛的應用。

美國GeneCopoeia（復能基因）為客戶提供50多種蛋白標簽，可以滿足客戶的不同需求，包括各種最新型的標簽，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等；也提供齊全的各種常用標簽，如eGFP、His、Flag等等標簽。

以下是部分蛋白標簽的特性介紹，更加詳細的介紹可在查詢克隆產品的結果列表里面看到各種推薦的蛋白標簽和載體。

標簽

His6

Flag

GST

MBP

His-MBP

HA

Myc

His-Myc

His-AviTag?

Sumo

His-Sumo

SNAP-Tag?

Halo Tag?

TrxHIS

純化 促進溶解度 抗體效價 細胞標記

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eGFP/CFP/YFP

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His6是指六個組氨酸殘基組成的融合標簽，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。當某一個標簽的使用，一是能構成表位利于純化和檢測；二是構成獨特的結構特征（結合配體）利于純化。組氨酸殘基側鏈與固態的鎳有強烈的吸引力，可用于固定化金屬螯合層析(IMAC)，對重組蛋白進行分離純化。使用His-tag有下面優點： ?

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標簽的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分別為~26KD和~30KD，一般不影響目標蛋白的功能；

His標簽融合蛋白可以在非離子型表面活性劑存在的條件下或變性條件下純化，前者在純化疏水性強的蛋白得到應用，后者在純化包涵體蛋白時特別有用，用高濃度的變性劑溶解后通過金屬螯和親和層析去除雜蛋白，使復性不受其它蛋白的干擾，或進行金屬螯和親和層析復性；

His標簽融合蛋白也被用于蛋白質-蛋白質、蛋白質-DNA相互作用研究；

His標簽免疫原性相對較低，可將純化的蛋白直接注射動物進行免疫并制備抗體。

可應用于多種表達系統，純化的條件溫和；

可以和其它的親和標簽一起構建雙親和標簽。

Flag標簽蛋白

Flag標簽蛋白為編碼8個氨基酸的親水性多肽（DYKDDDDK），同時載體中構建的Kozak序列使得帶有FLAG的融合蛋白在真核表達系統中表達效率更高。

FLAG作為標簽蛋白，其融合表達目的蛋白后具有以下優點：

FLAG作為融合表達標簽，其通常不會與目的蛋白相互作用并且通常不會影響目的蛋白的功能、性質，這樣就有利用研究人員對融合蛋白進行下游研究。

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融合FLAG的目的蛋白，可以直接通過FLAG進行親和層析，此層析為非變性純化，可以純化有活性的融合蛋白，并且純化效率高。

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FLAG作為標簽蛋白，其可以被抗FLAG的抗體識別，這樣就方便通過Western

Blot、ELISA等方法對含有FLAG的融合蛋白進行檢測、鑒定。

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融合在N端的FLAG，其可以被腸激酶切除（DDDK），從而得到特異的目的蛋白。因此現FLAG標簽已廣泛的應用于蛋白表達、純化、鑒定、功能研究及其蛋白相互作用等相關領域。

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MBP（麥芽糖結合蛋白）

MBP（麥芽糖結合蛋白）標簽蛋白大小為40kDa，由大腸桿菌K12的malE基因編碼。MBP可增加在細菌中過量表達的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。MBP標簽可通過免疫分析很方便地檢測。有必要用位點專一的蛋白酶切割標簽。如果蛋白在細菌中表達，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。純化：融合蛋白可通過交聯淀粉親和層析一步純化。結合的融合蛋白可用10mM麥芽糖在生理緩沖液中進行洗脫。結合親和力在微摩爾范圍。一些融合蛋白在0.2% Triton

X-100或0.25% Tween 20存在下不能有效結合，而其他融合蛋白則不受影響。緩沖條件為pH7.0到8.5，鹽濃度可高達1M，但不能使用變性劑。如果要去除MBP融合部分，可用位點特異性蛋白酶切除。

檢測：可用MBP抗體或表達的目的蛋白特異性抗體檢測。 GST(谷胱甘肽巰基轉移酶)

GST(谷胱甘肽巰基轉移酶) 標簽蛋白本身是一個在解毒過程中起到重要作用的轉移酶，它的天然大小為26KD。將它應用在原核表達的原因大致有兩個，一個是因為它是一個高度可溶的蛋白，希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一個是它可以在大腸桿菌中大量表達，起到提高表達量的作用。GST融合表達系統廣泛應用于各種融合蛋白的表達，可以在大腸桿菌和酵母菌等宿主細胞中表達。結合的融合蛋白在非變性條件下用10mM 還原型谷胱甘肽洗脫。在大多數情況下，融合蛋白在水溶液中是可溶的，并形成二體。GST標簽可用酶學分析或免疫分析很方便的檢測。標簽有助于保護重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其穩定性。在大多數情況下GST融合蛋白是完全或部分可溶的。

純化：該表達系統表達的GST標簽蛋白可直接從細菌裂解液中利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathione pharo)親和樹脂進行純化。GST標簽蛋白可在溫和、非變性條件下洗脫，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在變性條件下會失去對谷胱甘肽樹脂的結合能力，因此不能在純化緩沖液中加入強變性劑如：鹽酸胍或尿素等。

如果要去除GST融合部分，可用位點特異性蛋白酶切除。

檢測：可用GST抗體或表達的目的蛋白特異性抗體檢測。

HA

HA標簽蛋白，標簽序列YPYDVPDYA，源于流感病毒的紅細胞凝集素表面抗原決定簇，9個氨基酸，對外源靶蛋白的空間結構影響小, 容易構建成標簽蛋白融合到N端或者C端。易于用Anti－HA抗體檢測和ELISA檢測。

c-Myc

C-Myc標簽蛋白，是一個含11個氨基酸的小標簽，標簽序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-

Ser-Glu-Glu-Asp-Leu，這11個氨基酸作為抗原表位表達在不同的蛋白質框架中仍可識別其相應抗體。C-Myc tag已成功應用在 Western-blot雜交技術、免疫沉淀和流式細胞計量術中, 可用于檢測重組蛋白質在靶細胞中的表達。

eGFP

eGFP標簽蛋白，是增強型綠色熒光蛋白eGFP,激發波長為488nm，發射波長為507nm，其是由野生型綠色熒光蛋白GFP通過氨基酸突變和密碼子優化而來的。相對于GFP，eGFP熒光強度更強、熒光性質更穩定。同時載體中構建的Kozak序列使得含有eGFP的融合蛋白在真核表達系統中表達效率更高。eGFP作為標簽蛋白，其融合表達目的蛋白后具有以下優點： 不用破碎組織細胞和不加任何底物，直接通過熒光顯微鏡就能在活細胞中發出綠色熒光，實時顯示目的基因的表達情況，而且熒光性質穩定，被譽為活細胞探針。

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其自發熒光，不需用目的基因的抗體或原位雜交技術就可推知目的基因在細胞中的定位等情況。

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同時細胞內的其它產物不會干擾標簽蛋白檢測，從而使其檢測更顯得快速、簡便、靈敏度高而且重現性。

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其低消耗、高靈敏度檢測，十分適用于高通量的藥物篩選。因此現eGFP表達標簽被廣泛地應用于基團表達調控、轉基因功能研究、蛋白在細胞中的功能定位、遷移變化及藥物篩選等方面。

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此外由我公司提供的IRES雙順反子載體，可同目的基因共表達eGFP，用于目的基因的體內蛋白示蹤研究。

eYFP

eYFP標簽蛋白為增強型黃綠色熒光蛋白eYFP，激發波長為513nm，發射波長為527nm，其是由野生型黃綠色熒光蛋白YFP通過氨基酸突變和密碼子優化而來的。相對于YFP，eYFP熒光強度更強、熒光性質更穩定。同時載體中構建的Kozak序列使得含有eYFP的融合蛋白在真核表達系統中表達效率更高。eYFP作為標簽蛋白，其融合表達目的蛋白后具有以下優點：

不用破碎組織細胞和不加任何底物，直接通過熒光顯微鏡就能在活細胞中發出綠色熒光，實時顯示目的基因的表達情況，而且熒光性質穩定，被譽為活細胞探針。

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其自發熒光，不需用目的基因的抗體或原位雜交技術就可推知目的基因在細胞中的定位等情況。

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同時細胞內的其它產物不會干擾標簽蛋白檢測，從而使其檢測更顯得快速、簡便、靈敏度高而且重現性。

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其低消耗、高靈敏度檢測，十分適用于高通量的藥物篩選。因此現eYFP表達標簽被廣泛的應用與基團表達調控、轉基因功能研究、蛋白在細胞中的功能定位、遷移變化及藥物篩選等方面。

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此外由我公司提供的IRES雙順反子載體，可同目的基因共表達eYFP，用于目的基因的體內蛋白示蹤研究。

eCFP

eCFP標簽蛋白為增強型青色熒光蛋白eCFP，激發波長為433nm或453nm，發射波長為475nm或501nm，其是由野生型青色熒光蛋白CFP通過氨基酸突變和密碼子優化而來的。相對于CFP，eCFP熒光強度更強、熒光性質更穩定。同時載體中構建的Kozak序列使得含有eCFP的融合蛋白在真核表達系統中表達效率更高。eCFP作為標簽蛋白，其融合表達目的蛋白后具有以下優點： 不用破碎組織細胞和不加任何底物，直接通過熒光顯微鏡就能在活細胞中發出綠色熒光，實時顯示目的基因的表達情況，而且熒光性質穩定，被譽為活細胞探針。

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其自發熒光，不需用目的基因的抗體或原位雜交技術就可推知目的基因在細胞中的定位等情況。

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同時細胞內的其它產物不會干擾標簽蛋白檢測，從而使其檢測更顯得快速、簡便、靈敏度高而且重現性。

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其低消耗、高靈敏度檢測，十分適用于高通量的藥物篩選。因此現eCFP表達標簽被廣泛的應用與基團表達調控、轉基因功能研究、蛋白在細胞中的功能定位、遷移變化及藥物篩選等方面。

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Avi Tag

AviTag標簽蛋白是一個15 個氨基酸的短肽，具有一個單生物素化賴氨酸位點，與已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目標蛋白的N端和C端。融合表達后，可被生物素連接酶生物素化，為了純化重組蛋白選用低親和性的單體抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，除了用于蛋白質分離純化，還用于蛋白質相互作用研究。

Avi Tag標簽系統具有以下幾大優點:

無論在體外或者體內，幾乎所有的蛋白都可以在一個獨特的Avi Tag位點輕易且有效地被生物素化；

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生物素化是通過酶和底物的反應來實現，反應條件相當溫和而且標記的專一性極高；

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生物素Avi Tag只有15個氨基酸，對蛋白空間結構的影響非常小。

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SNAP-Tag

SNAP-Tag是新一代的蛋白標簽技術，不僅專一性極高而且穩定，最大的優點是適用于多種環境下的蛋白質檢測與純化，如活細胞內、溶液中、或固態相(如SDS-PAGE gels)等。

SNAP-Tag是從人的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移（O6-alkylguanine-DNA-

alkyltransfera）獲得。無論體內還是體外，SNAP-Tag都能與底物高特異性地共價結合，使蛋白標記上生物素或熒光基團（如熒光素和若丹明）。SNAP所帶的活性巰基位點接受了苯甲基鳥嘌呤所攜帶的側鏈苯甲基基團，釋放出了鳥嘌呤。這種新的硫醚鍵共價結合使SNAP所帶的目的蛋白攜帶上了苯甲基基團所帶的標記物。苯甲基鳥嘌呤在生化條件下穩定，并且沒有其他蛋白會和這類物質作用，所以SNAP標簽反應是高特異的。檢測：生物素或各種顏色熒光的底物（如熒光素、若丹明）可滲透進入細胞，方便快捷地進行活細胞內SNAP-Tag融合蛋白的標記與檢測。它們也可特異性地標記大腸桿菌，酵母和哺乳動物等細胞抽提液或已經純化的蛋白液中的SNAP-tag融合蛋白。 將純化的或未純化的SNAP-Tag融合蛋白與表面固定了苯甲基鳥嘌呤的基質混合，蛋白即可特異與底物作用，形成共價鍵，融合蛋白間接被固定在了基質表面上，可以達到更方便快捷地研究蛋白功能或純化蛋白的目的。

Halo Tag

HaloTag?標簽蛋白是一種脫鹵素酶的遺傳修飾衍生物，可與多種合成的HaloTag?配基有效地共價結合。這個分子量為33KDa的單體蛋白能融合在重組蛋白的N端或C 端，并在原核和真核系統中表達。

HaloTag?配基是小分子化學物，能夠在體外或體內與HaloTag?蛋白共價結合。這些配基由兩個關鍵組分組成：(1)一個通用的HaloTag?反應聯結子，結合HaloTag?蛋白；(2)一個功能基團,例如熒光染料或親和媒介。

能夠共價和特異性結合多種合成的報告基團和親和配基的特性，使得HaloTag?蛋白能夠用于檢測和親和結合或固相化固定目的蛋白。

SUMO

SUMO標簽蛋白是一種小分子泛素樣修飾蛋白（Small ubiquitin-like modifier），是泛素(ubiquitin)類多肽鏈超家族的重要成員之一。在一級結構上，SUMO與泛素只有18%的同源性，然而兩者的三級結構及其生物學功能卻十分相似。研究發現SUMO可以作為重組蛋白表達的融合標簽和分子伴侶，不但可以進一步提高融合蛋白的表達量，且具有抗蛋白酶水解以及促進靶蛋白正確折疊，提高重組蛋白可溶性等功能。

此外SUMO還有一項重要的應用，就是可用于完整地切除標簽蛋白，得到天然蛋白。因為SUMO蛋白水解酶（我公司可提供）能識別完整的SUMO標簽蛋白序列，并能高效地把SUMO從融合蛋白上切割下來。切除SUMO后，經過親和層析，去除標簽蛋白部分，就得到和天然蛋白一樣的重組蛋白。所以SUMO標簽也常用于和其他標簽一起應用，作為特異酶切水解位點。

熒光素酶（Lucifera）

熒光素酶不是標簽蛋白，但是由我公司提供的IRES載體，可同目的基因共表達螢火蟲熒光素酶基因，用于目的基因的體內蛋白示蹤研究。

熒光素酶（Lucifera）能催化熒光素氧化，在氧化的過程中，發出生物熒光，然后通過熒光測定儀或液閃測定儀就可以測定熒光素氧化過程中釋放的生物熒光。熒光素酶的優勢在于發生物熒光，無需激發，無本底的影響，所以相關線性程度高；而且螢火蟲熒光素酶在一般細胞中不會出現；熒光素酶分析的靈敏度很高，也容易操作；生物熒光的測定用簡單的手動或全自動的微孔板化學發光檢測儀都可以用；適合高通量篩選。 蛋白質融合表達的標簽及切割研究

引言近年來,一些抗原表位的肽類和蛋白質已被用于大量生產重組蛋白質.這些親和標簽系統具有以下特征:(a)一步的吸附純化,(b)對三級結構和生物活性影響小,(c)可方便且專一的去除以產生天然蛋白質,(d)在純化過程中重組蛋白的分析簡便準確,(e)適用于大量的不同蛋白質.有幾種不同的策略用于大規模生產重組蛋白質.其中一種辦法是使用很小的肽標簽,這些標簽不會與融合的蛋白質發生干擾.使用最為廣泛的有多聚精氨酸,FLAG-,多聚組氨酸-, S-, and Strep II-tag等. 對于某些應用,小標簽無需去除.這些標簽不像大標簽具有免疫原性,經常可以直接作為抗原用于產生抗體. 小標簽對于融合蛋白的三級結構和生物活性的影響取決于標簽的位置和氨基酸組成.另一種方法是使用大的肽類或蛋白質作為融合蛋白.，它們的使用可以增加目標蛋白的溶解性.缺點是對于一些應用如結晶或抗體產生等,標簽必須加以去除.一般來說,對于特定的目標蛋白很難決定最佳的融合系統.這取決于目標蛋白本身(如穩定性,疏水性),表達系統,純化后蛋白的用途.

1．融合標簽融合標簽的作用是用于檢測和純化目的蛋白，有時也用來增加目的蛋白在細胞質中的可溶性或幫助將目的蛋白運轉到細胞周質中以提高目的蛋白的生物活性。

1.1多聚精氨酸-標簽(Arg-tag)

精氨酸-標簽通常由5或6個精氨酸組成.它已被成功用作細菌C末端標簽,精氨酸是堿性最強的氨基酸,帶5個精氨酸標簽的蛋白質可以結合到陽離子交換樹脂SP-Sephadex上, 而大部分雜蛋白不結合.結合后,帶標簽的蛋白質在堿性pH下運行線性NaCl梯度洗脫得到.當C末端為疏水性區域時,多聚精氨酸可能影響蛋白質的三級結構.氨酸殘基的C末端序列可用羧肽酶B處理去除.這一酶促處理已被成功用于一些例子,但常常由于低的切割得率或者在期望的蛋白質序列間發生不必要的切割而受到限制.然而精氨酸標簽并不常用,與第二標簽聯用是很有趣的蛋白質純化工具.

1．2 多聚組氨酸-標簽(His-tag)

已廣泛采用的方法是利用固定化金屬螯合層析純化帶有由多聚組氨酸殘基組成的一個短的親和標簽的重組蛋白質.固定化金屬螯合層析的基礎是固定在基質上的過渡態金屬離子(Co2+, Ni2+,Cu2+, Zn2+)與特定的氨基酸側鏈之間的相互作用.組氨酸是與固定化金屬離子作用最強的氨基酸,組氨酸的咪唑環作為電子供體容易與固定的金屬離子形成配位鍵.基質材料洗滌之后,可通過調節柱緩沖液的pH或者添加游離咪唑洗脫含多聚氨基酸序列的肽類。雖然在變性條件下系統對于帶6個組氨酸標簽的蛋白質純化有效,帶3個組氨酸標簽的蛋白質在生理條件下可有效純化.然而帶6個組氨酸標簽的蛋白質可以在天然條件下,在低或高濃度鹽的緩沖液中結合到Ni2+-NTA 基質上.結合后,目標蛋白可用0.8到250 mM咪唑梯度洗脫.低濃度的咪唑(如0.8 mM)可減少帶有組氨酸的宿主蛋白質的非專一吸附.6個組氨酸標簽的蛋白質可用20到250mM咪唑濃度范圍洗脫. 使用咪唑的缺點是咪唑的存在經常導致蛋白質的聚集.另一種用于純化多聚組氨酸標簽蛋白質的材料是TALON.這由Co2+-羧甲基天冬氨酸(Co2+-CMA)組成,并偶聯到固相的樹脂上.TALON使得標簽蛋白在溫和條件下洗脫,已有報導與Ni2+-NTA樹脂相比,其非特異性蛋白結合更少,從而達到更高的洗脫產物純度.一種酶制劑通過SDS-PAGE鑒定的純度高于95%.

1.3 谷胱甘肽S-轉移酶-標簽

1988年首次描述了融合有谷胱甘肽S-轉移酶(GST)的多肽的一步純化.來自日本血吸蟲(schistosoma japonicum),26-kDa的 GST被克隆在大腸桿菌表達載體中.融合蛋白可從未經處理的裂解液中用固定化的谷胱甘肽親和層析加以純化.結合的融合蛋白在非變性條件下用10mM 還原型谷胱甘肽洗脫..GST標簽可用酶學分析或免疫分析很方便的檢測.標簽有助于保護重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其穩定性.在大多數情況下GST融合蛋白是完全或部分可溶的.推薦采用位點專一的蛋白酶如凝血酶或Xa因子從融合蛋白切除GST標簽.蛋白酶解后,GST載體和蛋白酶通過谷胱甘肽瓊脂糖親和層析去除.GST標簽可位于N端或C端,可用于細菌,酵母,哺乳細胞, 和桿狀病毒感染的昆蟲細胞. GST融合蛋白已成為分子生物學家的基本工具。

1.4 Strep-標簽(Strep-tag)

Strep-標簽是一氨基酸肽開發來用于在鏈球菌抗生物素蛋白(streptavidin)柱上親和純化相應的融合蛋白.鏈球菌抗生物素蛋白(streptavidin)在特定位點第44,

45, 和47位的突變體與天然形式相比,對八肽Strep-tag II的親和力更強,.Strep標簽的蛋白質在生理緩沖液條件下結合到生物素結合區域中,并可用生物素衍生物溫和洗脫.洗脫時推薦使用2.5 mM脫硫生物素.基質可以用4-羥基-偶氮苯-2-羧酸再生,這種物質在溶液中呈黃色,當結合到基質上則呈紅色.結合條件是非常專一的.生物素化的蛋白質如大腸桿菌的羧基載體蛋白可以結合,但生物素或者生物素化的蛋白質則用抗生物素封閉.純化條件是多種多樣的.螯合劑,溫和性去污劑,還原型去污劑,和高達1M的鹽可以加到緩沖液中. Strep-標簽系統適合用于研究蛋白質之間的相互作用以及當那些大的標簽或者帶電荷的標簽無效時的特殊用途.

1.5 S-標簽

S-標簽是個融合肽標簽可以通過快速靈敏的均勻分析或者在Western blot中用比色法加以檢測.該系統的基礎是15個氨基酸殘基的S-tag與103氨基酸殘基的S-蛋白質之間的強烈相互作用,這兩個都來自RNaA.S-蛋白質/S-標簽復合物的Kd接近0.1μM,這取決于pH,溫度和離子強度.標簽由4個帶正電荷殘基,3個負電荷殘基,3個不帶電的極性殘基和5個非極性殘基組成.這使S-標簽保持可溶.S-標簽的快速分析是基于核酸降解活力的恢復.標簽蛋白可以結合到S蛋白質基質上.洗脫條件較苛刻,如pH2.0的緩沖液.然而為了獲得有功能的蛋白質推薦用蛋白酶切割標簽.該系統可用于純化的重組蛋白質來源包括細菌,哺乳細胞和桿狀病毒感染的昆蟲細胞抽提物.該系統經常與第二標簽聯用.RNa酶A高度靈敏的熒光底物的發現使得該系統可用于與高通量篩選聯用的檢測.

2. 融合蛋白的切割

為了對目的蛋白進行生化及功能分析，通常要從目的蛋白上去除fusion tag部分。親和標簽的存在可能影響待研究蛋白的重要特性或功能.很早就已建立了數種對融合蛋白進行位點特異性裂解的方法。化學裂解如溴化氰(Met↓)等，不但便宜且有效，往往還可以在變性條件下進行反應。但由于裂解位點的特異性低和可能對目的蛋白產生的不必要修飾，使這個方法漸漸被酶解法取代。酶解的方法相對來說反應條件較溫和，更重要的是，普遍用于此用途的蛋白酶都具有高度的特異性。位點特異性蛋白酶(例如凝血酶、腸激酶、Xa因子和煙草蝕刻病毒(TEV)等)通常被用來切割融合蛋白。凝血酶在這三種中是特異性活性最高的，能夠有效切質量比僅為1:2000的蛋白。Xa因子似乎對于切點周圍的序列很敏感，經常會出現特異性位點切割不理想卻發生別的位點被切割的情況。腸激酶的專一性是上述三種中最好的，但由于切割效率低（通常要求質量比達到1:10）而顯得比較昂貴。在質量比比較高的酶切反應進行完后，通常要通過色譜法處理。比較方便可行的方法是采用生物素化凝血酶結合鏈親和素瓊脂糖一起使用。盡管沒有一種蛋白酶完美無缺，凝血酶還算的上是活性高、專一性好的典型。蛋白的標簽切割后不能降低蛋白質的活力. 另一個需要考慮的問題是：切割完成之后，是否需要去除蛋白酶。切割后蛋白酶的去除對于使用帶親和標簽的重組蛋白酶或者生物素化的蛋白酶較為容易.生物素化的蛋白酶可通過Strep-tag/Strep-Tactin親和層析直接加以純化。

1．腸激酶由于專一識別5個氨基酸多肽(D-D-D-D-K-X1)并在賴氨酸的羧基上切割,是N末端融合通常選擇的蛋白酶,在其他殘基的不規則切割發生水平較低,這取決于蛋白質底物的構象(Choi et al.2001). 腸激酶輕鏈的分子量為26.3kDa. 一個單位定義為在23℃下切割50ug 融合蛋白在8小時內達到95%切割率所需的酶量.生化分析已經表明切割效率取決于D4K識別位點下游的X1 氨基酸殘基.

蛋白酶是位點專一的蛋白酶,具有7個氨基酸殘基的識別位點,序列為 E-XX-Y-X-Q-S, 切割在兩個保守的谷氨酰胺和絲氨酸之間進行. X可以是各種氨基酸,但不是全部氨基酸都可行.最佳的切割序列為 E-N-L-Y-F-Q-S; .當TEV蛋白酶識別位點在兩個結構域之間是結果最理想.當切割不理想時,插入增加結構靈活性的小連接肽可改善效率. 高專一性,多種底物的活力以及低溫下的有效切割使TEV蛋白酶成為從融合蛋白移除標簽的理想工具.

3.凝血酶是一種廣泛用于切割標簽的蛋白酶.切割可在20到37℃之間切割0.3到16小時.與腸激酶相反,Xa因子和凝血酶切割后,在目標蛋白C末端增加了兩個氨基酸.凝血酶最佳的切割位點是X4-X3-P-R[K]-X1'-X2',這里X4 和 X3 是疏水氨基酸而X1'和 X2'是非酸性氨基酸.一些經常使用的識別位點是L-V-P-R-G-S,L-V-P-R-G-F,和MY-P-R-G-N在X4-X3-P-R-G-X2'之間切割比在X4-X3-P-K-L-X2'更有效.其他識別位點是 X2-R[K]-X1', 這里X2 或者 X1'是甘氨酸.例如A-R-G和G-K-A,這里切割發生在第二個殘基后.在凝血酶切割位點和N末端標簽之間插入五個甘氨酸殘基可改善切. 通過這一"甘氨酸連接肽"只需較少酶量就可達到完全切割,而且也可以避免可能發生的錯誤切割.有效的消化緩沖液是純的Tris緩沖液,pH8.0.在緩沖液中存在的NaCl具有抑制作用.凝血酶可從切割產物中用p-氨基瓊脂糖親和純化,或者supero-12 FPLC 柱凝膠過濾或者苯甲脒瓊脂糖移去.

4.在標簽和目標蛋白之間的Xa因子識別位點可作為有效的工具完全去除N末端的親和標簽.Xa因子在四氨基酸肽I-E[D]-G-RX1的羧基切割, 這里X1可以是除了精氨酸和脯氨酸以外的其他氨基酸.切割可以在4到25℃之間進行.絕大多數Xa因子的分子量大約43 kDa,由兩個二硫鍵連接的多肽組成,一條27 kDa,一條 16 kDa.在 SDS-PAGE,還原的肽鏈具有30 kDa 和20 kDa的表觀分子量. 通過位點專一的蛋白酶如Xa因子切除標簽有時候是無效的,有Xa因子切割非專一的報導.原因可能是融合蛋白的不溶性或者變性劑的存在.可通過引入5個氨基酸的多聚甘氨酸區域來增加切割.丹磺酰氯-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸-氯甲基酮在室溫下1分鐘內可使Xa因子活性不可逆失活95%.雖然由于切割需要更長的孵化時間而且效率較低而使Xa因子越來越少使用,但仍有使用Xa因子的成功報導。

裂解融合蛋白以除去fusion tag

IMPACT系統的推出是融合表達系統的一個重大突破。該系統最大的優點是表達的融合蛋白無需蛋白酶裂解即可實現目的蛋白與fusion tag的精確切割。IMPACT(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag)系統利用一個來源于枯草桿菌的5kDa大小的幾丁質結合域（chitin binding domain，用于親和純化）和一個來源于酵母intein蛋白質組成一個雙效的fusion tag，再與克隆到多克隆位點的目的基因融合表達。Intein是一個蛋白質剪接元件，類似于基因組中的內含子intron在RNA的剪接中所起的重要作用，intein在較低的溫度和還原條件下發生自身介導的N端裂解，可以釋放出與之相連的目的蛋白。也就是說融合表達產物在掛上親和層析柱后只需要在低溫（4度）條件下用含DTT，或者巰基乙醇，或者半胱氨酸的溶液洗脫，即可將目的蛋白洗脫，而將fusion tag留在純化柱上。而還原劑的小分子可以非常簡單的去除。該系統的出現是融合表達系統的重大突破，完全避免了蛋白酶的使用，不但可以有效降低成本，提高效率，也避免了蛋白酶與目的蛋白的分離純化的麻煩。

隨后推出的IMPACT-CN系統提供了兩種選擇，即fusion tag可以選擇在目的蛋白的C端或者N端，使克隆或表達都能滿足不同需要。但是這一系統仍然有一個缺陷，那就是含有較多二硫鍵的蛋白不適用這一系統，因為還原劑的存在會破壞/影響蛋白的二級結構。

IMPACT—TWIN的推出為我們帶來了更大的驚喜。在多克隆位點的兩端各有一段intein和幾丁質結合域的fusion tag，提供了三種選擇：1、在克隆時切掉N端的fusion tag 1，插入目的基因，同原來的系統一樣，可以在表達產物掛上親和純化柱后加入還原劑，將目的蛋白從fusion tag上解離并洗脫下來，得到的目的蛋白C端帶有硫酯鍵，可以直接用于連接一個標記物、非編碼氨基酸或者另一個蛋白；2、在克隆時切掉C端的fusion tag 2并插入目的基因，當表達產物掛上親和純化柱時只需要改pH值和溫度（pH7, 25度）即可將目的蛋白從fusion tag上解離并洗脫下來。這不但避免了蛋白酶的使用，更重要的是也避免了還原劑對含豐富二硫鍵的蛋白二級結構的破壞。由于調節緩沖液的pH值非常方便且無需另外去除洗脫產物中的還原劑，這大大地簡化了目的蛋白的純化過程，也擴大了該系統的應用范圍。3、可以將目的基因插入兩個fusion tag之間，這樣表達產物的兩端都含有fusion tag，當產物掛上親和純化柱并經過兩級洗脫后，由于目的蛋白兩端分別有一個硫酯鍵和半胱氨酸，可以自身環化得到環形蛋白。

結論

親和標簽在蛋白質純化過程中時很重要的,可以有助于穩定蛋白質并提高其溶解性.親和層析 通常可以達到90-99%的純度.純化系統的選擇取決于蛋白質本身及其進一步的應用.有時候 融合蛋白由于其標簽沒有暴露到表面而不能加以純化.在變性條件下或者將標簽置于蛋白質的另一個末端可以解決這個問題.在許多情況下,第二親和標簽用于第二步親和層析以增加純度.作為選擇,一個標簽用于純化而另一個用于檢測.如果兩個不同的標簽放在不同的末端,則全長產物可通過兩步親和層析得到.多個標簽也是可能的,每一個標簽用于特定的用途.多個標簽還可以連續多步純化達到高純度.這些高度純化的蛋白質使得檢測蛋白質之間的相互作用成為可能. Xa因子、凝血酶、腸激酶、凝乳酶、膠原酶等蛋白酶都具有較長的底物識別序列(如在凝乳酶中為7個氨基酸)，從而降低了蛋白質中其他無關部位生斷裂的可能性。選擇一種合適的酶至關重要，要綜合考慮酶的成本（這些蛋白酶價格一般都相當昂貴），反應時間，特異性，更重要的是蛋白酶本身能混入目的蛋白中，造成新的污染，提高純化的復雜性。