端粒末端G-四聯體結構的形成以及

2023年12月31日發(作者：書院二小松)

端粒末端G-四聯體結構的形成以及

以G-四聯體結構為靶點的端粒酶抑制劑研究進展

07102108 王婷婷

摘要：端粒是真核細胞染色體末端的特殊結構，由簡單的DNA片段重復而成，這些片段多富含G，因此這種DNA被稱為富-G DNA。G-四聯體就是單鏈部分的富-G DNA在特定的離子強度和PH值條件下形成的結構。腫瘤細胞中這種結構的形成可抑制端粒酶的活性，使端粒長度穩定機制遭到破壞。因此G-四聯體成為目前抑癌手段的新熱點。

關鍵詞：G-四聯體 端粒 端粒酶抑制劑 富-G DNA

1.端粒和端粒酶

端粒作為一種特殊的染色體末端的結構，存在于真核生物細胞中，由端粒DNA和端粒蛋白質組成。其中，端粒DNA的G堿基含量很多，經常由簡單的富G-DNA片段高度重復而成。端粒具有高度的保守性和種屬特異性。

1.1端粒存在的意義

在DNA復制過程中，由于其只能從5’端向3’端順序復制，新生成的DNA中只有一條單鏈是順序復制下來的，另一條單鏈則會以RNA引物加上岡崎片段的形式復制。 其中一條新單鏈5’端會被RNA引物先行占據。（圖1）

圖1 DNA復制

當復制完成后，RNA引物會自行脫下，接著由DNA連接酶識別每個岡崎片段的末尾，對其與下一個岡崎片段的開頭進行連接（從上圖中看是從右向左進行連接）。這時就出現了一個問題，那條新單鏈的5’端（最右端）沒有上個岡崎片段的末尾，DNA連接酶不能補全它由于RNA引物的脫去而缺失的部分。這個問題被稱為末端隱縮。

有端粒存在的情況下，在染色體進行復制時，丟失的部分只是一段高度重復的DNA（在上圖中也就是存在于原DNA的3’端，并不含有翻譯后有意義功能的序列）——即一部分端粒，用這種方法保證了染色體的完整復制，這是端粒的主要作用之一。當然，因為染色體是互補配對進行復制的，所以在DNA的5’端也有端粒的序列，以保證子代DNA的3’端在下次復制時不會丟失重要序列。由此可見，端粒是真核生物進化過程的產物，因為它的存在，

復雜的染色體復制機制才可以周而復始地進行下去。

由于每次都是子代DNA的5’端不能復制原DNA的序列，所以相比較而言，子代DNA3’端比5’端的序列要長。由此類推，所有DNA的端粒部分，3’端都比5’端要長一些。這和下面介紹的G-四聯體的形成息息相關。

除此之外，端粒位于染色體的末端，還可以有效避免染色體相互之間的融合，避免核酸酶將染色體降解。有一個很好的比喻——端粒就如同一條鞋帶末端的膠圈，沒有膠圈，鞋帶末端就會開始散開，鞋帶也就失去了使用的價值。在染色體中，失去端粒將意味著基因的不穩定，基因突變和基因丟失的幾率增加，也會因此觸發細胞的凋亡機制。比如P53抑癌基因，它的觸發就源于細胞中端?？s短到一定的臨界長度，這個細胞再生長增殖下去已經對生物體的基因穩定有威脅，于是會由P53來誘導此細胞凋亡。由此，細胞中如果端粒維持在一定的長度，細胞便不會凋亡，腫瘤細胞便是如此。究竟是什么導致了腫瘤細胞中的端粒不會縮短呢？答案是端粒酶。

1.2 端粒酶的作用

端粒酶是一種逆轉錄酶，由RNA，蛋白質以及催化亞基組成。它能以自己的RNA為模板合成端粒DNA序列，維持甚至增長端粒的長度，這一切的前提是在端粒酶有活性的情況下。在胚胎期，端粒酶的活性很高，很多組織中都能測出它的存在。但隨著細胞的分化，端粒酶的活性很快下降，因為其基因表達受到抑制。在正常情況下，除了在干細胞，造血細胞等必須不斷分裂的細胞中，仍能檢測出端粒酶的活性外，其余的細胞中均沒有有活性的端粒酶的存在。這說明，端粒酶的活性在正常細胞中受到很嚴密的調控。

而在惡性腫瘤細胞中，幾乎都可以測到端粒酶的活性。這使得惡性腫瘤細胞的端?？偰鼙谎娱L而保持一定的安全長度，染色體將永遠完整的被復制，細胞因此不會走向凋亡，只會不斷增殖擴散。

2 G-四聯體

G-四聯體是G-四聯體螺旋的基本單位，也是四聯體DNA的一種特例。

2.1 G-四聯體的形成

以人的DNA為例，在端粒末端靠近3’一端是富含G重復序列的的，比如重復序列TTAGGG（同理，另一端5’端則富含C，即是AATCCC）。這種富含G的DNA被稱為-G DNA。而上面提到，端粒末端3’端總比5’端要長一些，被稱為“端粒尾”，所以端粒尾既是-G DNA又是單鏈DNA。

……

圖2 人端粒末端序列

1989年，Sundpuist和Klug發現在一定條件下，人工合成的模擬一種原生動物棘毛蟲的DNA中，富-G的單鏈DNA可形成四聯體結構。由此他們推測端粒尾也形成了四聯體結構。1992年，Klug通過X-射線晶體衍射實驗證實，富-G的DNA片段的確能夠形成四聯體結構。

四聯體DNA是由富-G DNA單鏈在特定離子強度和pH值條件下，由4條或4段富-G

DNA單鏈形成的一段平行右旋的四聯體DNA。當DNA重復片段中G成串排列時，形成的四聯體更具代表性，稱為G-四聯體螺旋。G-四聯體螺旋中的基本單位，就是G-四聯體。

2.2 G-四聯體的結構

圖3 G-四聯體的結構 圖4 G-四聯體螺旋結構

G-四聯體是4個G由8條氫鍵形成的平面，每個G既是氫鍵配體又是氫鍵的受體。因為G-四聯體的中心有4個帶負電的羰基，所以中心往往會螯合一個正離子，這個正離子會使整個G-四聯體的結構更為穩定。這個穩定的作用是根據正離子大小改變而改變的，大小越接近于中心“口袋”的大小，就會使整個結果越穩定。另外，在大小合適的基礎上，螯合的正離子價態越高，G-四聯體結構越穩定。

穩定的G-四聯體螺旋擁有多種形態。首先，從形成四聯體的鏈的數量上看，可以由四條鏈，兩條鏈，甚至一條鏈形成的三種G-四聯體螺旋。

圖5a 一條鏈 圖5b 兩條鏈 圖5c 四條鏈

其次，由鏈的排列方向上看，G-四聯體螺旋有四條鏈都平行，和兩條鏈平行（另兩條鏈反平行）兩種情況。

圖6a 四條鏈平行 圖6b 兩條鏈平行

再有，根據離子螯合的位置也有下面幾種不同情況。

圖7 不同的離子螯合情況

除此之外，四聯體中的苷鍵構型也有兩種：全反或是交替順反。這種構型的不同也與鏈的平行情況有關。

圖8 苷鍵不同構型

3 以G-四聯體結構為靶點的端粒酶抑制劑

3.1 G-四聯體與端粒酶的關系

在端粒酶發揮作用時，必須要將自己的RNA序列與端粒末端的DNA序列相互識別并結合，才能延長端粒的長度。此時的端粒末端，應當呈現的是鏈狀的一級結構。G-四聯體是端粒末端往往會形成的二級結構，也就是說，當端粒末端呈現G-四聯體螺旋時，端粒酶便不具有結合位點，它的活性將被抑制。所以，我們要尋找與G-四聯體結合并維持其穩定性的小分子，以抑制端粒酶的活性。

3.2 以G-四聯體為靶點的小分子端粒酶抑制劑

3.2.1 蒽醌類藥物

2,6-二酰胺蒽醌衍生物BSU 1051是第一個以G-四聯體為靶點的端粒酶抑制劑，在此之后，人們發現很多蒽醌化合物都具有穩定G-四聯體結構的作用，主要機制是與雙鏈DNA結合。但也因為此作用，這種抑制劑對細胞的毒性很大。

圖9 2,6-二酰胺蒽醌衍生物BSU 1051結構式

3.2.2 吖啶類藥物

吖啶類化合物與蒽醌類化合物結構相似，但抑制端粒酶活性的效果比蒽醌類化合物更強。主要原因在于吖啶類化合物稠環中的N原子能質子化，從而帶一定的正電荷，因此能更準確地螯合在G-四聯體的中心部位，增強其結構的穩定性。

圖10 吖啶類化合物結構式

3.2.3 卟啉類藥物

與上述兩種化合物不同的是，卟啉類化合物對G-四聯體的結構有很高的選擇性。不同的卟啉類化合物與不同的G-四聯體結合對端粒酶的活性抑制效果不同。卟啉類化合物同G-四聯體的結合主要通過堆積作用。

圖11 卟啉類化合物結構式

3.2.4 二萘嵌苯類藥物

N,N’-雙[2-(1-哌啶基)乙基]-3,4,9,10-北四甲酰二亞胺同卟啉類化合物類似，通過外向堆積作用與G-四聯體結合。需要說明的是，此種化合物不但能夠穩定G-四聯體的結構，還能促進G-四聯體的形成，對DNA單、雙鏈的作用很小。不同的二萘嵌苯類化合物對不同結構的G-四聯體亦有很高的選擇性。

圖12 二萘嵌苯類化合物結構式

3.2.5 溴乙啶類藥物

溴乙啶是一種DNA二聚體的插入劑，它的作用機理是通過插入在G-四聯體之間而穩定G-四聯體結構的形成。G-四聯體與溴乙啶結合會產生熒光效果，常被用作分子熒光探針。

圖13 溴乙啶類化合物結構式

3.2.6 花青染料類藥物

雖然花青染料類化合物中只有很少的幾種可與G-四聯體結合以抑制端粒酶的活性，但花青染料DODC可以雙分子發夾型G-四聯體特異性結合，顯示出特殊的光譜特征，常被當做此類G-四聯體的分子探針。

圖14 花青染料類化合物結構式

3.2.7 三吖嗪類藥物

三吖嗪類化合物的作用機理在于可以明顯升高G-四聯體的解鏈溫度。并且有實驗發現：腫瘤細胞在該類化合物中長期培養，結果是端?？s短和細胞衰老，這種現象與起始的端粒長度有關。

圖15 三吖嗪類化合物結構式

4 結語

以G-四聯體為靶點的端粒酶抑制劑相關研究已經成為現在的抑癌熱點之一。G-四聯體的穩定性會受到周圍環境的影響，而小分子通過各種途徑增強G-四聯體的穩定性，使端粒酶的結合位點受到封閉，從而打破端粒長度穩定機制，這是一個嶄新的治療惡性腫瘤的途徑。有些小分子對正常細胞亦有毒害作用以及其他尚未成熟的方法，都需要我們進一步的努力研究。

參考資料

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