211249972_正電超分子手性介質的點擊構筑及氨基酸高效拆分——化學實

2024年3月6日發(作者：物業管理)

58 Univ. Chem. 2023, 38 (4), 58–67

?化學實驗? doi: 10.3866/202210051 正電超分子手性介質的點擊構筑及氨基酸高效拆分

——化學實驗課程思政探索與實踐

杜延麒1，李汝婧1，楊紀同1，李媛1，靳曉寧1,2,*，王勇1,2,*

1天津大學理學院，天津 300354

2化學化工國家級實驗教學示范中心(天津大學)，天津 300354

摘要：手性是生命的本質屬性，分子手性與生命現象的精細調控息息相關。不同對映體藥物的藥理、毒理高度差異化。面對快速增長的手性藥物市場，發展高效精準手性拆分策略，已成為當前醫藥領域的迫切需求。本實驗面向新工科2.0，首次提出構建“手性拆分工坊”綜合實驗構想。利用點擊化學綠色合成策略實現單正電環糊精的高效接枝，構筑正電超分子手性介質，探討基于分子間弱相互作用的手性識別機制，藉此發展外消旋氨基酸衍生物的高效色譜手性拆分方法，優化手性色譜分離條件，獲得丹磺酰氨基酸的精準拆分規律。實驗立足新工科化學專業建設，涵蓋綠色合成、儀器分析、物化機制和無機材料等基礎化學知識，并融合前沿技術理論及產業應用，打造課程思政引導的化學專業人才培養新范式。

關鍵詞：正電環糊精；綠色點擊化學；課程思政；化學實驗

中圖分類號：G64；O6

Click Construction of Cationic Chiral Supramolecular Medium for

Efficient Enantioparation of Amino Acids: Exploring and Practicing

Ideological and Political Education in Chemical Experiment Curriculum

Yanqi Du

1, Rujing Li

1, Jitong Yang

1, Yuan Li

1, Xiaoning Jin

1,2,*, Yong Wang

1,2,*

1 School of Science, Tianjin University, Tianjin 300354, China.

2 National Demonstration Center for Experimental Chemistry & Chemical Engineering Education, Tianjin University, Tianjin

300354, China.

Abstract: Chirality is the esntial attribute of life. Molecular chirality is cloly related to the fine regulation of life

phenomena. The pharmacology and toxicology of drugs with different enantiomers vary significantly different. Owing to the

recent advancements in the chiral drug market, the development of efficient and accurate chiral paration strategy has

become critical. Aiming at the construction of new engineering subjects 2.0, the idea of “chiral paration workshop”

comprehensive experiment was propod for the first time. The chiral recognition mechanism bad on intermolecular weak

interaction was investigated using the click-chemical green synthesis strategy to realize the highly efficient grafting of single-positively charged cyclodextrins and the construction of positively charged supramolecular chiral media; the chiral paration

conditions of racemic amino acid derivatives were optimized, and the resolution of racemic dansyl amino acids were obtained

as well. The experiment is bad on the construction of new engineering chemistry specialty, covering the basic chemical

knowledge of green synthesis, accurate instrument analysis, physical and chemical paration mechanism, and inorganic

material chemistry, as well as integrating the advanced technical theories and industrial applications, thereby creating a new

收稿：2022-10-20；錄用：2022-12-20；網絡發表：2023-01-31

*通訊作者，Emails:********************(靳曉寧);*******************(王勇)

基金資助：天津大學第四批課程思政教改項目(序號97)

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No. 4 doi: 10.3866/202210051 59

paradigm for the cultivation of chemistry talents under the guidance of ideological and political education.

Key Words: Cationic cyclodextrin; Green click chemistry; Cour ideology and politics; Chemistry experiment

1 引言

1.1 聚焦國家戰略，開啟高質量綜合實驗新征程

“生命為什么需要手性？”是2021年Science發布的125個重大未解科學問題之一。手性廣泛存在于自然界，是生命體的本質屬性[1]，與人類的生存休戚相關。R-型的沙利度胺是一種鎮靜劑，而S-型的沙利度胺則具有嚴重致畸性。面對急速增長的手性藥物種類和市場，發展高效精準手性拆分手段[2]，獲取高純單一對映體手性藥物，既是當前醫藥領域的前沿熱點，也是我國目前面臨的卡脖子技術之一。

深化新工科化學專業教育改革，推進化學專業教育的高質量發展，對建設高等教育強國具有重大意義。“手性拆分工坊”綜合實驗是聚焦天然氨基酸手性拆分這一科學難題，依托化學前沿理論、化學合成策略、化學測量方法等相關理論技術，將手性拆分相關基礎、方法、應用高度融合而提出的新實驗理念[3] (圖1)。以高質量人才培養為基礎，激發學生對生命本質的探索欲，鍛煉學生的實驗技術綜合技能，提升學生的國家和社會責任感。同時本實驗也是科教融合，多個二級學科相交叉的基礎應用創新化學實驗，能切實提升化學專業本科生培養的“兩性一度”(高階性、創新性、挑戰度)。

圖1 “手性拆分工坊”設計理念

1.2 擬選用拆分對象及背景介紹

氨基酸是生命起源物質，通過肽鍵連接成多肽，調控體內物質代謝和信息傳遞[4]，由于氨基酸分子手性碳相連的特殊官能團較少，其高效手性拆分是分離領域的前沿難點。作為第二代超分子主體化合物，環糊精(CD)是由6–8個D-吡喃葡萄糖手性單元組成的環狀大分子[5]，其獨特的疏水手性空腔結構與表面極性羥基賦予其優秀的分子識別特性(圖2a)

[6]，對羥基進行功能化可引入更多協同作用位點并調節其分子構象進而賦予其更強大的識別能力[7]。

基于上述背景，本實驗將依托?-CD優秀的手性識別空腔，并對其6位羥基進行定點精修，引入吡啶鎓強陽離子作用位點，通過CD空腔包合作用、強靜電作用以及氫鍵作用構建系列丹磺酰氨基酸(圖。

2b)精準手性拆分體系[8]，打造“手性拆分工坊”1.3 設計實驗的方法思路

在前期研究基礎上，本實驗采用全綠色化學接枝方法，以乙醇和水為溶劑，通過高效點擊化學手段將單乙烯基吡啶鎓CD超分子接枝于巰基硅膠表面，獲得一種全新的硫醚橋聯正電CD手性介質(合成Copyright?博看網. All Rights Rerved.

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設計見圖3)，以核磁共振氫譜、紅外光譜、元素分析等手段對中間產物和目標產物進行結構鑒定，研究裝柱方法并制備成手性柱成品。依托高效液相色譜技術，探索氨基酸手性拆分色譜條件，研究不同對映體保留機制，建立依托上述手性柱的氨基酸精準拆分方法，完成“工坊”構建。

圖2 (a)

?-環糊精結構；(b) 四種丹磺酰氨基酸立體結構圖

圖3 手性固定相(CSP)的設計制備路線

2 實驗部分

2.1 實驗原理

本實驗主要涉及合成和識別兩部分原理，一是點擊化學接枝原理；二是正電環糊精超分子手性識別原理。

2.1.1 單正電超分子環糊精手性介質的點擊構筑

點擊化學反應機理如圖4所示，偶氮二異丁腈(AIBN)在加熱條件下生成氰基異丙基自由基，奪取巰基硅膠中的氫原子，生成硫自由基，再與4-乙烯基吡啶鎓CD發生自由基加成，生成芐基自由基，奪取巰基中的氫原子，生成目標產物CSP的同時產生硫自由基完成反應循環。

2.1.2 手性氨基酸衍生物的拆分原理

手性拆分本質是利用兩種對映異構體分子與手性選擇劑之間的差異化作用實現分離。根據經典的“三點作用”模型，氨基酸萘環疏水部可進入環糊精空腔形成匹配包合，其結構中與手性碳相鄰的脂肪側鏈引起的空間效應有助于提升環糊精手性選擇性，氨基酸羧酸根陰離子可與環糊精吡啶鎓形成強靜電相互作用，羰基與環糊精羥基可形成氫鍵協同作用，籍此可形成不同的對映體包合構象，從而實現丹磺酰氨基酸的精準拆分(圖5)

[9]。

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圖4 “巰基-烯”點擊反應機理

圖5 正電環糊精手性識別原理

2.2 試劑或材料

TsO-CD與巰基硅膠可由實驗室自制準備或購買，其他試劑見表1。

表1 實驗所用主要試劑

試劑名稱

無水乙醇

純度/規格

分析純

制造商

天津市科密歐化學試劑有限公司

試劑名稱

N,N-二甲基甲酰胺

(DMF)

乙腈

色譜純

天津市康科德科技有限公司

氘代二甲亞砜

(DMSO-d6)

甲醇

色譜純

天津市康科德科技有限公司

偶氮二異丁腈

(AIBN)

三乙胺

色譜純

天津市康科德科技有限公司

丹磺酰-α-氨基丁酸(Dns-Aba)

乙酸

色譜純

天津市康科德科技有限公司

丹磺酰亮氨酸

(Dns-Leu)

丙酮

分析純

天津渤化化學試劑有限公司

丹磺酰-2-氨基己酸

(Dns-Nle)

4-乙烯基吡啶 > 96.0%

上海邁瑞爾

丹磺酰苯丙氨酸

(Dns-Phe)

> 99.0%

德國默克化學試劑

> 99.0%

德國默克化學試劑

> 99.0%

德國默克化學試劑

> 99.0%

德國默克化學試劑

分析純

上海阿拉丁生化科技股份有限公司

> 99.9%

安諾倫(北京)生物科技有限公司

純度/規格

> 99.8%

制造商

上海麥克林生化科技有限公司

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2.3 儀器和表征方法

本實驗所用主要儀器見表2。

表2 實驗所用主要儀器

儀器名稱 型號 制造商

分析天平 BSA124S 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司

核磁共振譜儀 AVANCE Ⅲ HD 400 MHz 德國Bruker公司

德國Bruker公司 傅里葉變換紅外光譜儀 ALPHA

壓力填柱泵 P10SNXP1 美國LabAlliance

高效液相色譜儀 1260 美國Agilent Technologies

pH計 Five Easy Plus 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司

鄭州長城科工貿有限公司 循環水式多用真空泵 SHB-Ⅲ

2.4 實驗方法

2.4.1 單-6-(4-乙烯基吡啶)-β-CD的制備

將干燥的TsO-CD 1.94 g (1.5 mmol)溶解到10 mL無水DMF中，加入1.1 mL (10.2 mmol) 4-乙烯基吡啶。95 °C下磁力攪拌，回流反應2 h。反應后將溶液緩慢滴加到30 mL丙酮中，有大量固體析出。減壓過濾，用丙酮充分洗滌，干燥得到目標產物TsO-Py-CD，產物為淡黃色粉末。

2.4.2 CSP的“巰基-烯”點擊制備

將2.0 g TsO-Py-CD分散到乙醇和去離子水(體積比 1 : 1)的混合溶液(30 mL)中，攪拌溶解，加入巰基硅膠2.0 g和催化劑AIBN 0.05 g，60 °C磁力攪拌回流反應2 h。減壓過濾，依次用水、乙醇、丙酮洗滌，干燥得到目標產物CSP。

2.4.3 色譜柱的裝填

采用高壓勻漿填充法將所制備的CSP裝入不銹鋼柱(100 mm?4.6 mm I.D. )，以甲醇作為分散劑。裝填過程持續30 min，裝柱壓力4.137 × 107

Pa (6000 psi)，流速為10 mL·min?1。裝完柱后，標記好流向，將色譜柱以正確方向安裝于HPLC。

2.4.4 高效液相色譜的實驗方法

采用高效液相色譜反相模式進行拆分研究。本實驗選用MeOH/TEAA (三乙胺-乙酸水體系緩沖液)作為流動相。TEAA的配制方法是：將三乙胺(TEA)溶于純凈水中，用乙酸調節pH得到所需TEAA緩沖溶液。所有的分析物均溶解在MeOH/H2O (體積比1 : 1)中，配制成濃度為1 mg·mL?1的溶液，進樣量均為10 μL。所有緩沖溶液和樣品在使用前均經過0.45 μm的濾膜過濾并超聲脫氣。根據丹磺酰氨基酸紫外吸收光譜，設定檢測波長范圍為220 nm。除特殊說明外，每個樣品均重復進樣三次，所得結果取平均值。保留因子k，選擇因子α和分離度RS均采用USP標準進行計算。

tR?????t0 k??=??t0k2α??=??

k1tR??2???????tR??1??Rs??=??

W1/2(1)??+??W1/2(2)離度；當RS > 1.5時，認為兩物質能基線分離。

(1)

(2)

(3)

其中，tR為對映體的保留時間，t0為死時間；W1/2為色譜峰的半峰寬值。?為選擇性因子，RS為分

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3 結果與討論

3.1 TsO-Py-CD和CSP的結構表征

采用FTIR和核磁共振氫譜對所合成的單正電CD進行結構表征。在FTIR光譜(圖6a)中，與TsO-CD相比，TsO-Py-CD在~1658 cm?1處的C＝C雙鍵伸縮振動吸收峰明顯增強，初步說明吡啶基團的引入。1H NMR譜圖(圖6b)顯示，TsO-Py-CD中苯環氫(H1’，H2’)的化學位移明顯向高場移動，可歸因于苯環質子周圍電子云密度增加，屏蔽作用增強，證明對甲苯磺酰基已脫離CD母體成為離子，并且出現了全新的吡啶質子吸收峰(H1，H2)。TsO-Py-CD的13C NMR譜圖(圖6c)中可以明顯看到位于130附近的吡啶環碳原子吸收峰，以及位于100附近乙烯基碳原子吸收峰(C5，C6)，進一步證明吡啶環的引入。上述分析結果證實了TsO-Py-CD的成功合成。

圖6 TsO-Py-CD和TsO-CD的FTIR圖(a)、1H NMR圖譜對比圖(b)及TsO-Py-CD的13C NMR圖譜(c)

利用FTIR、熱失重分析、固體核磁和元素分析對點擊反應制備的CSP進行表征。在FTIR光譜圖中(圖7a)，相比HS-SiO2，CSP在2940 cm?1附近的―CH2―伸縮振動峰明顯增強，說明乙烯基吡啶CD成功鍵合到巰基硅膠表面。在熱失重分析中(圖7b)，相比巰基硅膠，CSP的失重差明顯增大，說明巰基硅膠表面已被成功修飾。從固體核磁譜圖中(圖7c)可以明顯看到吡啶環和CD骨架的吸收峰，進一步證明了乙烯基吡啶CD的成功鍵合。結合元素分析結果(表3)，CSP的C、H、N的百分含量與HS-SiO2相比均有較大程度提升且S的含量顯著下降，根據式(4)

[10]計算得出CSP的CD固載量達到0.48 ?mol·m?2，證明點擊化學可成功制備超分子CSP。

??C%)(106)??2 N (μmol·m) =

(4)

??C%)(S.A.)(nC)(12.001)(100 ? (????))??nC??(12.001)其中，C%：CSP中碳元素的總含量； S.A.：球形硅膠的比表面積；nC：每個β-CD分子中碳原子數；Mr：CSP中相比于硅膠增加結構部分的分子量。

圖7 巰基硅膠和CSP的FTIR圖(a)、TGA曲線(b)、CSP固態核磁共振光譜(c)

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表3 巰基硅膠和CSP的元素分析結果

樣品名稱

氮含量/%

碳含量/%

氫含量/%

硫含量/%

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HS-SiO2 0.04 3.56 1.39 1.45

CSP 0.45 10.78 2.27 0.95

3.2 流動相條件結果討論

鑒于流動相中有機相組成、pH、離子強度和有機相配比等色譜條件均可對丹磺酰氨基酸的分離結果有重要影響，因此，本實驗對各因素進行詳細考察，以期獲得最佳分離條件。

3.2.1 流動相中有機溶劑種類的影響

本實驗首先考察兩種常用有機溶劑乙腈(ACN)和MeOH對丹磺酰氨基酸的影響。由圖8可看出，以Dns-Aba為例，有機溶劑為MeOH時，CSP分離效果明顯優于ACN。這主要歸因于ACN極性明顯弱于甲醇，與CD空腔有更強的疏水包合作用。另外由于MeOH是質子型溶劑，會參與主客體包合形成三元配合物，增強主客體包合穩定性。因此選用MeOH為丹磺酰氨基酸手性拆分的優選有機溶劑。

圖8 流動相中有機溶劑種類對Dns-Aba拆分影響

3.2.2 流動相pH的影響

對于丹磺酰氨基酸，流動相pH直接影響其帶電行為，從而影響靜電相互作用。本實驗先選用MeOH/TEAA緩沖液(體積比50 : 50)，考察流動相中緩沖液pH對分離效果的影響。考慮氨基酸衍生物的弱酸性，實驗采用pH = 4、5、6、7、8五種緩沖溶液分析對CSP拆分行為的影響。結果如圖9所示，以Dns-Aba為例，隨著pH從4變化到8，分析物的保留因子、選擇性和分離度呈現先增大后減小的趨勢。這是由于在保留因子和選擇性達到峰值之前，分析物中羧基的電離隨著溶液堿性的增強而增強，更多的―COO?使得分析物與正電CSP的作用增強，從而導致保留因子和選擇性增大。綜合考慮分離時間和拆分效果，本實驗選擇pH為6進行后續實驗。

3.2.3 離子強度的影響

離子強度對酸堿性化合物電離、環糊精包合以及硅膠表面電荷抑制都有影響。因此，本實驗固定最優pH = 6，調整TEA體積濃度比，分別考察0.4%、0.6%、0.8%、1.0%和1.2%五種離子強度對Dns-Aba保留值的影響，同時分析CSP對Dns-Aba的色譜拆分行為。由圖10看出，當流動相中離子強度從0.4%增加到1.2%，分析物的保留因子呈現減小趨勢、選擇性基本維持不變化但分離度呈現先增大后減小趨勢。這是由于流動相中TEA陽離子濃度的增加，對硅膠表面的―SiO?基團有屏蔽效應，有助于提高柱效。同時流動相中的TEA也會競爭CD空腔，離子強度越大，CD和分析物的相互作用就越弱。綜合考慮拆分效果和分離時間，本實驗選擇最佳離子強度為1.0%。

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圖9 流動相pH對Dns-Aba拆分的影響

圖10 離子強度對Dns-Aba拆分的影響

3.2.4 流動相比例的影響

本實驗固定上述最優pH和離子強度，調整MeOH/TEAA比例，分析CSP對Dns-Aba的色譜拆分行為。由圖11看出，當MeOH的比例從60%降低到35%，分析物的保留因子、選擇性和分離度均呈現上升趨勢，當甲醇比例降至45%時，已能夠實現基線分離。這是由于MeOH和分析物都會競爭CD空腔，甲醇比例越大，CD和分析物的相互作用就越弱。綜合考慮拆分效果和分離時間，本實驗選擇最佳流動相MeOH/TEAA比例為45 : 55 (體積比)。

3.2.5 對映體保留順序分析

為進一步探究正電CD與不同構型的氨基酸對映體作用強弱，本實驗分別考察所制備的CSP對對映體樣品的洗脫順序。以Dns-Aba為例，通過相同條件下保留值定性，發現Dns-Aba的L構型要先于D構型出峰，說明CSP和Dns-Aba的D-構型作用力更強，能形成更穩定的主客體包合物(圖12)。

3.2.6 外消旋體定量分析

根據式(5)使用面積歸一化法進行定量分析，由于對映體的紫外吸收完全相同，因此相對校正因子fD = fL，由軟件積分獲得各自積分面積(AD，AL)，經計算可知樣品Dns-Leu中L構型含量為57.0%，D構型含量為43.0%。

fDADwD??=????×??100%

(5)

fDA??+??fDALLCopyright?博看網. All Rights Rerved.

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圖11 流動相比例對Dns-Aba拆分的影響

圖12 不同構型氨基酸保留順序

3.2.7 CSP色譜柱評價

為了考察CSP的穩定性能，實驗在最佳流動相條件(MeOH/TEAA (1.0%，pH = 6) 體積比45 : 55)下進行了日間重復實驗。以Dns-Aba為例，對比結果如圖13所示，色譜峰未發現明顯變化，且保留因子、選擇性和分離度的標準偏差均小于0.1%，充分說明CSP的穩定性，證明了點擊化學接枝手段的有效性。

圖13 Dns-Aba在最佳流動相條件下日間重復性實驗

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3.2.8 CSP的普適性考察

以MeOH/TEAA (1.0%，pH = 6) 體積比45 : 55為流動相，進一步考察了該CSP手性拆分的普適性。對丹磺酰氨基酸類對映體進行拆分，發現大部分樣品都具備拆分效果。如圖14，除了Dns-Aba，CSP也對Dns-Leu、Dns-Nle和Dns-Phe色譜拆分結果較好。

圖14 CSP對丹磺酰氨基酸類對映體的拆分結果

(a) Dns-Leu；(b) Dns-Nle；(c) Dns-Phe

4 結語

“手性拆分工坊”是以建立手性對映體藥物精準拆分方法為目標的創新綜合實驗，以卡脖子技術和國家重大需求為導向，融合思政，首次引入工坊式創新實驗理念，把工廠搬進實驗室，注重教學中化學基礎研究創新和自主知識產權建立，聚“產教學研用”五位一體，既頂天又立地。實驗匯集化學多領域理論及實驗知識，時長可控制在16學時，非常適合本科生綜合化學實驗。實驗亦可模塊化分解。如：有機合成CSP可作為8學時有機化學實驗；液相色譜精準拆分手性氨基酸可作為4學時的儀器分析實驗。本實驗還高度外延，引入氨基酸衍生化實驗、分子對接計算化學實驗，直至海量數據支撐下的人工智能實驗，構建化學為基礎學科的交叉性大綜合實驗，打造“科教融合應用型人才培養”新范式，讓學生成為我國高等教育改革的受益者，勇挑國家戰略建設的重擔。

參 考 文 獻

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