膜片鉗

膜片鉗技術原理與基本操作

1976年Neher和Sakmann建立了膜片鉗技術（Patchclamptechnique），這

是一種以記錄通過離子通道的離子電流來反映細胞膜上單一的或多數的離子通

道分子活動的技術。1981年Hamill,Neher等人又對膜片鉗實驗方法和電子線路

進行了改進，形成了當今廣泛應用的膜片鉗實驗技術。該技術可應用于許多細胞

系的研究，也是目前唯一可記錄一個蛋白分子電活動的方法，膜片鉗技術和克隆

技術并駕齊驅給生命科學研究帶來了巨大的前進動力，這一偉大的貢獻，使Neher

和Sakmann獲得1991年諾貝爾醫學與生理學獎。

一、膜片鉗技術的基本原理

用一個尖端直徑在1.5~3.0m的玻璃微電極接觸細胞膜表面，通過負壓吸引

使電極尖端與細胞膜之間形成千兆歐姆以上的阻抗封接，此時電極尖端下的細胞

膜小區域（膜片，patch）與其周圍在電學上分隔，在此基礎上固定（鉗制，Clamp）

電位，對此膜片上的離子通道的離子電流進行監測及記錄。

基本的儀器設備有膜片鉗放大器、計算機、倒置顯微鏡、示波器、雙步電極

拉制器、三軸液壓顯微操縱器、屏蔽防震實驗臺、恒溫標本灌流槽、玻璃微電極

研磨器。膜片鉗放大器是離子單通道測定和全細胞記錄的關鍵設備，具有高靈敏

度、高增益、低噪音及高輸入阻抗。膜片鉗放大器是通過單根電極對細胞或膜片

進行鉗制的同時記錄離子流經通道所產生的電流。膜片鉗放大器的核心部分是以

運算放大器和反饋電阻構成的電流-電壓（I-V）轉換器，運算放大器作為電壓控

制器自動控制，使鉗制電位穩定在一定的水平上。

二、操作步驟

1.膜片鉗微電極制作

(1)玻璃毛細管的選擇：有二種玻璃類型，一是軟質的蘇打玻璃，另一是硬質的

硼硅酸鹽玻璃。軟質玻璃在拉制和拋光成彈頭形尖端時錐度陡直，可降低電極的

串聯電阻，對膜片鉗的全細胞記錄模式很有利；硬質玻璃的噪聲低，在單通道記

錄時多選用。玻璃毛細管的直徑應符合電極支架的規格，一般外部直徑在

1.1~1.2mm。內徑1mm。

(2)電極的拉制：分二步拉制。第一部是使玻璃管中間拉長成一窄細狀，第二次

拉制窄細部位斷成二根，其尖端直徑一般在1~5m，充入電極內液后電極電阻在

1~5M為宜。調節第一步和第二步拉制時加熱線圈的電流強度，即可得到所需

要的電極尖端直徑。電極必須保持干凈，應現用現拉制。

(3)涂硅酮樹酯：記錄單通道電流時，為了克服熱噪聲、封接阻抗噪聲及電極浸

入溶液產生的浮游電容性噪聲，需要在電極尖頸部（距離微電極尖端50mm）的

表面薄薄地涂一層硅酮樹酯（sylgard），它具有疏水性、與玻璃交融密切、非導

電性的特性。涂完硅酮樹酯的玻璃微電極須通過加熱的鎳鉻電阻線圈烘干變固，

以防硅酮樹酯順著電極流向尖端而影響千兆封接。烘干后才能進行熱磨光。

(4)熱磨光(heatpolish)：一般在玻璃研磨器下對電極尖端進行熱磨光，磨光后可

使電極尖平滑并燒去過多的硅酮樹酯薄膜，有利于千兆封接的形成。目前大多數

實驗室在作全細胞模式記錄時，不涂硅酮樹酯也不進行熱磨光，也可形成很好的

千兆封接。

(5)電極液的充灌：目前最常應用的是用注射器反向充灌。用細長的注射器針頭

或拉細的聚乙烯膠管從電極尾端插入到電極尖端，再進行灌注。灌注后電極尖端

有少許氣泡，排除氣泡的方法是用左手拿住電極，尖端向下，用右手輕輕彈擊電

極，可見氣泡徐徐上升直至排除。電極液不要充灌太滿，能與探頭的銀絲接觸上

即可，溶液過多會浸入探頭支持架致使潮濕而影響實驗記錄。

2.溶液的組成

(1)電極液：根據記錄的電流不同電極液的成分也不同。基本要求是等張的KCI

溶液，Ca2+濃度為10~100nmol(pCa7~8)，pH值7~7.4。這里介紹一個在全細胞

記錄模式時，通過改變保持電位，能分別記錄到Na+、K+、Ca2+電流的電極液

成分(mmol/L)：KAspartic49.89，KCI30.37，KH

2

PO

4

25，HEPES20.12，EGTA

0.999，KOH29.95，MgCl21，CaCl

2

0.2，ATPNa

2

6.8。用KOH調pH至7.4。

如果要記錄純的Na+、K+、Ca2+電流，則需要使用相應的工具藥。

HEPES（N-2-hydroxyethyopiperazine-N’-2-ethanesulfonicacid，羥乙基哌嗪乙烷磺

酸）

(2)細胞外液（浴槽液）：分離細胞和記錄電流時應用。分離神經細胞主要用人

工腦脊液（artificialcerebrospinalfluidsolution，ACSF），成分（mmol/L）：NaCl124，

KCl2.5，NaH

2

PO

4

1.25，MgSO

4

2.0，CaCl

2

2，NaHCO

3

26，gluco10。該液體

需要通以95%O

2

＋5%CO

2

混合氣體。如果用HEPES作緩沖系，則ACSF的成

分如下（mmol/L）：NaCl140，KCl2.5，MgCl

2

1，CaCl

2

1，gluco25，HEPES10。

上述溶液的配制均使用去離子水。

3.神經細胞的分離

運用膜片鉗技術進行電生理學研究需要制備合適的單個細胞作標本，細胞制

備的好壞直接影響實驗的成功率。膜片鉗實驗要求細胞標本具有呼吸活性、耐鈣、

細胞膜完整、平滑、清潔度高的條件，以利于微電極與細胞膜進行高阻封接。活

性好的細胞在形成全細胞模式后可以保持活性很長時間，足以保證實驗的順利進

行。因此制備好的細胞標本是膜片鉗實驗的關鍵第一步。

七十年代以來，出現了許多分離各類細胞的分離技術，但是進行電生理學研

究尤其是膜片鉗實驗多應用酶解分離細胞的方法。我們實驗室曾分離過豚鼠心室

肌細胞、大鼠肝臟細胞、大鼠腦皮層神經細胞、家兔肺動脈平滑肌細胞和人腦皮

層神經細胞及人心房肌細胞。

這里重點介紹大鼠腦皮層神經細胞的分離技術。

(1)用30mg/kg戊巴比妥鈉ip麻醉后，斷頭開顱取出大腦半球放入冷的人工腦

脊液中，輕輕剝離腦膜和血管等纖維組織，然后取腦皮層在人工腦脊液中剪成

2mm2mm的組織塊靜止1小時，并通以氧氣。

(2)將腦組織塊放入含有protea16unit/ml(typeⅩ,sigma)和protea2unit/ml

(typeⅩⅣ,sigma)的人工腦脊液中，在36℃恒溫震蕩(60次/min)水浴中孵育60分

鐘左右。

(3)將組織塊取出，反復用人工腦脊液沖洗５次，以徹底清除消化酶，于室溫下

靜止60分鐘并繼續通氧，實驗前將組織塊輕柔吹打后即可分離出單一的神經細

胞供實驗使用。

4.千兆歐姆封接

取一滴細胞液，滴入浴槽中，用人工腦脊液進行灌流，將浮游的死細胞沖走，

待細胞貼壁后即可進行封接吸引。通過PCLAMP軟件或電子刺激器，給予一個

20mV，10~50ms的矩形波刺激，當電極進入浴槽溶液時，記錄電流的直線變成

與矩形波電壓脈沖相對應的矩形波曲線，將電極尖輕輕壓在細胞膜表面，此時電

流曲線的高度變低，給電極以負壓吸引，由于電極尖與細胞膜逐漸密接，細胞膜

與電極間的電阻逐漸增加，電流曲線逐漸減小

直至變成一條直線，則形成了千兆歐姆封接。

5．記錄模式

根據研究目的選擇記錄模式，主要有下面敘述的前４種，后３種是依據前４種變

更而來的。(1)細胞貼附式(cell-attached或on-cellmode)：千兆歐姆封接后的狀

態即為細胞貼附式模式，是在細胞內成分保持不變的情況下研究離子通道的活

動，進行單通道電流記錄。即使改變細胞外液對電極膜片也沒有影響。

(2)膜內面向外式(inside-outmode)：在細胞貼附式狀態下將電極向上提，電極

尖端的膜片被撕下與細胞分離，形成細胞膜內面向外模式。此時膜片內面直接接

觸浴槽液，灌流液成分的改變則相當于細胞內液的改變。可進行單通道電流記錄。

此模式下細胞質容易滲漏(washout)，影響通道電流的變化，如Ca2+通道的

run-down現象。

(3)全細胞式(whole-cellmode)記錄：在細胞貼附式狀態下增加負壓吸引或者

給予電壓脈沖刺激(zapping)，使電極尖端膜片在管口內破裂，即形成全細胞記

錄模式。此時電極內液與細胞內液相通成為和細胞內電極記錄同樣的狀態，不僅

能記錄一個整體細胞產生的電活動，并且通過電極進行膜電位固定，也可記錄到

全細胞膜離子電流。這種方式可研究直徑小于20m以下的小細胞的電活動；也

可在電流鉗制(currentclamp)下測定細胞內電位。目前將這種方法形成的全細胞

式記錄稱作常規全細胞模式(conventionalwhole-cell

mode或holecellmode)。

(4)膜外面向外式(outside-outmode)：在全細胞模式狀態下將電極向上提，使電

極尖端的膜片與細胞分離后又粘合在一起，此時膜內面對電極內液，膜外接觸的

是灌流液。可在改變細胞外液的情況下記錄單通道電流。

(5)開放細胞貼附膜內面向外式(opencell-attachedinside-outmode)：在細胞貼

附式狀態下，用機械方法將電極膜片以外的細胞膜破壞，從這個破壞孔調控細胞

內液并在細胞貼附式狀態下進行單通道電流記錄。用這種方法時，細胞越大，破

壞孔越小，距電極膜片越遠，細胞因子的流出越慢。

(6)穿孔膜片式(perforatedpatchmode)或緩慢全細胞式(slowwhole-cellmode)：

在全細胞式記錄時由于電極液與細胞內液相通，胞內可動小分子能從細胞內滲漏

到電極液中。為克服此缺點，可在膜片電極內注入制霉菌素(nystatin)或二性霉

素Ｂ(amphotericin使電極膜片形成多數導電性小孔，進行全細胞膜電流記錄，

故被稱為穿孔膜片式或制霉菌素膜片式(nystatin-patchmode)。又因胞質滲漏極

慢，局部串聯阻抗較常規全細胞記錄模式高，鉗制速度慢，故也稱為緩慢全細胞

式。

(7)穿孔囊泡膜外面向外式(perforatedvesicleoutside-outmode)：在穿孔膜片式

基礎上，將電極向上提，使電極尖端的膜片與細胞分離后又粘合在一起形成一個

膜囊泡。如果條件很好，在囊泡內可保留細胞質和線粒體等，能在比較接近正常

的細胞內信號轉導和代謝的條件下進行單通道記錄。

6.細胞內灌流方法：

細胞內灌流是在全細胞式狀態下利用電極內灌流法形成的。電極內灌流法

的裝置是由電極固定部、灌流液槽、注入管、流出管、電極記錄用瓊脂橋所組成。

注入管是用直徑2.5mm的塑料管經加熱拉細制成，使其尖端能插到接近電極的

尖頂部。灌流液槽注滿實驗用溶液，插入注入管，當千兆封接形成后，由于負壓

吸引的作用電極內液從流出管流入排液槽的同時，實驗用溶液由流入管注入到電

極內，電極充滿實驗用溶液后關閉注入管，完成了液體的交換。這種方法應用在

“內面向外式”時，可同時改變細胞內液和細胞外液的組成；應用在“全細胞式”時

就形成了細胞內灌流方法，直接改變了細胞內液。

7.全細胞記錄模式離子通道電流記錄

(1)鈉通道電流(INa)：灌流液即細胞外液同人工腦脊液液，也可加入CoCl

2冬天用英語怎么說

3

mmol/L或nifidipine10mol/L以阻斷鈣電流。電極液成分(mmol/L)：CsCl150,

EGTA11,CaCl

2

1,MgCl

2

1,HEPES10,用CsOH調pH至7.4。

電壓鉗制方案，通常設保持電位(holdingpotential)為-80mV，去極化電壓為

-10~+40mV，步階電壓10mV，去極化的保持時間（刺激脈沖寬度或鉗制時間）

10~40ms。當全細胞記錄方式形成后，利用上述電壓鉗制方案，即可記錄出INa。

根據實驗數據制作電流-電壓(current-voltage,I-V)關系曲線，從中找到Na+電

流的激活電位、反轉電位和最大電流的電壓區域。

(2)鈣通道電流(ICa)：灌流液有兩種方案，一是人工腦脊液中加入TTX

10mol/L，另一是將人工腦脊液中的NaCl換成N-methyl-D-glucamine

130mol/L,pH用CsOH調至7.4。電極液的組成(mmol/L)：Asparticacid60,CsOH

60,MgCl

2

4,HEPES10,EGTA10,Na

2

ATP3。用CsOH調pH至7.4。通常使用的

電壓鉗制方案是設保持電位為-40mV，去極化電壓為10~110mV，步階電壓10

mV,鉗制時間300ms，此方案記錄的是L型Ca2+通道電流；但在此保持電位下

記錄到的Ca2+電流尚含有Na+通道電流或尚有T型Ca2+通道電流。記錄由于

沒有特異的T型Ca2+通道阻滯劑，若想獲得較純凈的L型Ca2+通道電流，將

保持電位抬高到-30mV即可。記錄T型Ca2+通道電流的電壓鉗制方案是設保

持電位為-80mV，仍以10mV的步階電壓去極，去極化電壓為10~170mV，應用

L型Ca2+通道阻滯劑，如：nitrendipine、nisodipine、nifedipine等，即可得到

較純凈的T型Ca2+通道電流。兩種方案得出的膜電流峰值，均可繪制I-V曲線。

(3)鉀通道電流：神經細胞上亦存在多種K+通道，其研究也很復雜，通常最直

觀最容易觀察和記錄得到的K+通道電流不外乎幾種。這里僅就延遲整流通道、

內向整流通道及瞬間外向電流通道的電流記錄加以介紹。

基本液體灌流液的組成(mmol/L)：N-methyl-D-glucamine135,KCl5.4,CaCl

1.8,

MgCl

2

0.5,HEPES10,Gluco5.5。用HCl調pH至7.4。也可在灌流液中加入

TTX

(10-6mol/L)和Cd+(0.2~0.5mmol/L)，以阻斷Na+和Ca2+通道。電極溶液為通常

的細胞內液。①延遲外向整流電流(delayedrectifieroutwardcurrent,Ikr)：設保

持電位為–80mV，去極化電壓為-20~+170mV，步階電壓10mV,鉗制時間可

這在100~400ms，時間間隔為2~3ms以上。有時可將保持電位設在–30mV或

–40mV，這樣不僅可以使T型Ca2+通道失活，記錄出Ikr，而且也可以同時記

錄到尾電流(Itail)，尾電流也是延遲外向整流電流的一種表現形式，當鉗制方波

從+70mV或+90mV復極到保持電位時，這個電流并不緊隨，而是延遲于復

極的鉗制方波，以指數衰減方式，逐漸回至電流右下腹部隱痛的原因女性 基線。現認為Itail和Ikr使用

同一通道。Ikr值的表示，通常是測定鉗制方波就要結束時的外向電流幅值；Itail

的測定是在鉗制初期上升的幅值。

②內向整流電流(inwardrectifiercurrent,Ikir)：在膜超極化時內向整流通道開

放，K＋流入細胞內，當膜電位近于靜息電位或更正時，該通道趨于關閉。一般

情況下保持電位的設置與細胞的靜息電位相當，設在–80mV，在這個電位下，

膜電位為“零”，保持電位是“零”電流電位。然后令鉗制電位從正于保持電位的方

向，向超極化方向復極，超極化可達-140mV到–160mV，過度超極化可能會

損傷細胞，步階電壓仍為10mV

在神經細胞，Ikir于鉗制初期可表現出一個瞬間內向電流，很快衰減，之后趨

于平衡，形成時間不依賴性或稱為持續性電流。測量電流幅度是測瞬間電流峰值

和持續性電流峰值。分別繪制其I-V曲線，再做分析。

③瞬間外向電流(transientoutwardcurrent,IA或Ito)：用于記錄Ito的電壓鉗

制方案與延遲整流電流的方案基本一樣，通常將保持電位設在–80mV，但這種

電壓鉗制方案在記錄到的Ito中，一定混有Ikir。目前可用兩種方法將其分開。

第一，設置兩個電壓鉗制方案，

即：第一個方案中的保持電位為–80mV，鉗制電位為+50mV頭像男動漫呆萌可愛 或更高，時間為

80~100ms，目的在于最大程度世界杯名單 地記錄到Ito。第二，如用改變保持電位的方法仍

不能分開Ito和Ikir，則可用某些阻斷劑(如E-4031、TEA等)阻斷Ikir，然后

利用方案一記錄Ito。然而，實際上要得到較純凈的Ito是相當不容易的，這其

中包括：在某些細胞Ito和Ikir對膜電位的依賴性太接近，以及到目前為止尚未

有十分特異的Ikir阻斷劑。由于TEA這類阻斷劑的特異性差，

所有應用時要格外小心，應使用特異性較好的阻斷劑。在K+通道的研究中，也

可應用斜坡(ramp)鉗制方案。其基本要點是膜電位斜坡除極

的速度不要太快。通常將膜電位從–110mV斜坡除極到+70mV或更高，旨在

使這一鉗制方案覆蓋整個生理電位活動范圍。在神經細胞，斜坡鉗制所得到的

K+電流包含幾種類型K+通道電流，其中有Ikr、Ito、Ikir等，也就是記錄到

的應是一條多類型的K+電流組成的電流軌跡。不同類型的K+通道阻滯劑可以

分別阻斷這一電流軌跡的不同部分。實驗者可在上述原則基礎上設計適用于不同

K+通道研究的斜坡鉗制方案。

8.單通道電流記錄

(1)鈉通道電流(INa)：用“細胞貼附式”膜片時，細胞外液為人工腦脊液，電極

液為無鈣的人工腦脊液(Na+140mmol/L)保持電位與去極化電壓的設置同全細

胞記錄方式，施加50ms的去極化脈沖，可記錄到單通道INa。為便于觀察，使

通道開閉的速度變慢，實驗需在較低的溫度(22~24℃)下進行。INa表現為內向

（向下）的矩形波狀的變化。將保持電位從靜息電位鉗制到–130mV，處于超

極化狀態下，給予1縮小比例 0mV步階電壓的去極化脈沖，鈉通道開放數逐漸增多，可

得到一個近似于用全細胞模式記錄出現的INa波形。

(2)鈣通古代頭飾圖片 道電流(ICa)：為準確控制膜電位，在記錄Ca2+電流時，應將灌流液

換成高鉀(K+濃度130mmol/L)溶液，此時細胞靜息電位約為0mV，通過保持

電位的設置可以較準確的控制細胞膜電位；也可用人工腦脊液灌流，但此時細胞

的靜息電位約為–80mV，設置保持電位時應考慮到這一點。電極液與全細胞記

錄時應用的細胞外液類似。電壓條件與全細胞記錄相同。

用細胞貼附式或膜內面向外式記錄單通道ICa時，常用的高鉀灌流液的組成

（mmol/L）：

K-aspartate90，KCl30，KH

2

PO

4

10，EGTA1，MgCl

2

0.5，CaCl

2

0.5。用KOH

調pH至7.4。電極液組成(mmol/L)：BaCl

2

50,CholineCl或TEACl70,HEPES

10,EGTA0.5。用CsOH調pH至7.4。

應注意的是，并不是每次去極化都能使鈣通道開放，常常見到鈣通道全部不開的

情況(blanktrace)，腎上腺素能神經激動劑、鈣通道激動劑如BayK8644能延長

通道開放時間。

(3)鉀通道電流：細胞K+在正常生理濃度時，鉀通道的電導很小，K+電流也

非常小，測定很困難，因此在記錄鉀通道電流時，應將電極內（膜片外）液的

K+濃度增加到140~150mmol/L。電壓條件與全細胞模式記錄時相同。

單通道電流記錄的主要觀察指標包括：單通道電導(conductance)，開放概

率(openprobability)，平均開放時間(meanopentime)，平均關閉時間(meanclo

time)。一般說來，單通道記錄和分析均較全細胞電流的記錄和分析的難度大且

更復雜．