一、目的
1.了解感受態細胞生理特性及制備條件，掌握大腸桿菌感受態細胞制備方法。
2.掌握質粒DNA 轉化大腸桿菌的方法，了解轉化的條件和利用半乳糖苷酶基因插入失活選擇重組質粒DNA 的原理。
二、原理
〔一〕大腸桿菌感受態細胞制備的原理
所謂感受態，是指細菌生長過程中的某一階段的培養物，只有某一生長階段中的細菌才能作為轉化的受體，能承受外源DNA而不將其降解的生理狀態。感受態形成后，細胞生理狀態會發生改變，出現各種蛋白質和酶，負責供體DNA 的結合和加工等。細胞外表正電荷增加，通透性增加，形成能承受外來的DNA 分子的受體位點等。本實驗為了把外源DNA〔重組質粒〕引入大腸桿菌，就必須先制備能吸收外來DNA分子
的感受態細胞。在細菌中，能發生感受態細胞是占極少數。而且，細菌的感受態是在短暫時間發生。
目前對感受態細胞能承受外來DNA 分子的本質看法不一。主要有兩種假說：
1、局部原生質體化假說――細胞外表的細胞壁構造發生變化，即局部失去細胞壁或局部溶解細胞壁，使DNA 分子能通過質膜進細胞。證據有：
〔1〕發芽的芽孢桿菌容易轉化；
〔2〕大腸桿菌的原生質體不能被噬菌體感染，卻能受噬菌體DNA 轉化；
〔3〕適量的溶菌酶能提高轉化率。
2、酶受體假說――感受態細胞的外表形成一種能承受DNA 的酶 位點，使DNA分子能進入細胞。證據是：〔1〕蛋白質合成的抑制劑如氯霉素，可以抑制轉化作用；
〔2〕細胞分裂過程中，一直有局部原生質化，但感受態只在生長對數期的中早期出現；
〔3〕別離到感受態因子，能使非感受態細胞轉變為感受細胞。
目前對感受態細胞的轉化理論尚未有統一結論，但是許多實驗室一直進展探索，試圖從實驗中獲得明確答復。有人根據pBR322 質粒DNA對E?coli K――12X1776菌株的轉化結果，認為：
近來，在許多研究室都發現CaCl2對受體菌處理，可提高轉化效率幾十倍，通常把細胞懸浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴條件下，放置過夜，轉化率轉高，但一過24小時，轉化率測恢復為原來的水平。
〔二〕重組DNA 的轉化原理
我們已經制備好大腸桿菌感受態細胞，接下的實驗是把重組的DNA 引入受體細胞，使受體菌具有新的遺傳特性，并從中選出轉化子。作為受體的大腸桿菌C600 或DH5α，必須不同外來DNA分子發生遺傳重組，通常是rec基因缺陷型的突變體，同時它們必須是限制系統缺
陷或限制與修飾系統均缺陷的菌株。這樣外來的DNA分子不會受其限制酶的降解。保持外來DNA分子在受體細胞中的穩定性。制備的大腸桿菌細胞就具有這三種缺陷〔rk- mk- rec- 〕同時此受體細胞還是氨芐青霉素敏感〔Ap〕。
在體外構建好的重組分子上具有分解氨芐青霉素〔Ap〕基因存在，當它導入受體細胞后，就賦于這些受體細胞新的特性，即Ap 抗性。同時載體質粒上具有乳糖操縱的β一半乳糖苷酶基因(lacZ)，我們可以利用外源基因插入載體β一半乳糖苷酶基因(lacZ)，使其失去β一半乳糖苷酶活性的原理來選擇新構建的重組子。
因pUC18帶有Ampr 基因而外源片段上不帶該基因,故轉化受體菌后只有帶有pUC18 DNA的轉化子才能在含有Amp的LB平板上存活下來;而只帶有自身環化的外源片段的轉化子那么不能存活。此為初步的抗性篩選。
pUC18 上帶有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調控序列和β-半乳糖苷酶N 端146 個氨基酸的編碼序列。這個編碼區中插入了一個多克隆位點,但并沒有破壞lacZ 的閱讀框架,不影響其正常功能。E.coli DH5α菌株帶有β-半乳糖苷酶C 端局部序列的編碼信息。在各自獨立的情況下,pUC18 和DH5α編碼的β-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。但在pUC18 和DH5α融為一
體時可形成具有酶活性的蛋白質。這種lacZ 基因上缺失近操縱基因區段的突變體與帶有完整的近操縱基因區段的β-半乳糖苷酸陰性突變體之間實現互補的現象叫α-互補。
由α-互補產生的Lac 細菌較易識別，它在生色底物X-gal(5-溴-4 氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)存在下被IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導形成藍色菌落。當外源片段TGFβⅠ插入到pUC18 質粒的多克隆位點上后會導致讀碼框架改變,表達蛋白失活,產生的氨基酸片段失去α-互補能力,因此在同樣條件下含重組質粒的轉化子在生色誘導培養基上只能形成白色菌落。由此可將重組質粒與自身環化的載體DNA 分開。此為α-互補現象篩選。
本實驗是把外來重組分子和感受態細胞在低溫下混合，使其進入受體細胞。DNA分子轉化的原理較復雜：
1、吸附――完整的雙鏈DNA 分子吸附在受體菌外表。
2、轉入――雙鏈DNA 分子解鏈，單鏈DNA 分子進入受體菌，另一鏈降解。
3、自穩――外源質粒DNA 分子在細胞又復制成雙鏈環狀DNA。
4、表達――供體基因隨同復制子同時復制，并被轉錄和翻譯。
對DNA 分子來說，能被轉化進受體細胞的比率極低，通常只占DNA 分子的0.01%，改變條件，提高轉化率是很有可能的，一些研究說明以下因素可以提高轉化率：
〔1〕受體菌細胞與DNA 分子兩者比例在1.6×108 細胞：1毫微克DNA分子〔4.3Kb〕左右轉化率較好；
〔2〕DNA 分子與細胞混合時間為1小時最正確；
〔3〕鋪平板條件會影響轉化率；
〔4〕對不同轉化菌株熱處理〔效應不一致〕。
除上述因素外，轉化試驗還注意如下問題：
1、連接DNA 反響液與受體細胞混合時，一定保持在冰浴條件下操作，如果溫度時高時低，轉化效率將極差。
2、熱處理2 分鐘后，要迅速加進1 毫升LB 以使表型表達，延遲加LB，將使轉化率迅速降低。
3、在平板上涂布細菌時。注容防止反復來回涂布，因為感受態細菌的細胞壁有了變化，過多的機械壓涂布將會使細胞破裂。影響轉化率。
三、材料
〔一〕儀器與器皿
恒溫振蕩器 分光光度計 電動沉淀離心機 旋渦混合器 恒溫培養箱隔 電熱恒溫 水浴鍋 恒溫搖床 普通冰箱 Eppendorf管 轉液管 平皿 涂布棒 微量取樣器 微波爐 三角燒瓶 試管 刻度離心管 保溫瓶 酒精燈等
〔二〕菌種
大腸桿菌C600 或DH5α〔rk rec mk〕
〔三〕培養基與試劑
1.LB 液體培養基〔1%蛋白胨 0.5%酵母粉 0.5%NaCl pH7.5。〕
2、100mmol/ L CaCl2
3.氨芐青霉素溶液〔50 毫克/毫升〕
4.DNA 連接反響液
5.X-gal 儲液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal 配制成20mg/ml的儲液,包以鋁箔或黑紙以防止受光照被破壞,儲存于-20℃。
6.IPTG儲液(200mg/ml): 在800μl蒸餾水中溶解200mg IPTG后,用蒸餾水定容至1ml,用0.22μm濾膜過濾除菌，分裝于eppendorf管并儲于-20℃。
7.含Amp 的LB 固體培養基:將配好的LB 固體培養基高壓滅菌后冷卻至60℃左右,參加Amp 儲存液,使終濃度為50μg/ml,搖勻后鋪板。
8.含X-gal 和IPTG 的篩選培養基：在事先制備好的含50μg/ml Amp的LB 平板外表加40ml X-gal儲液和4μlIPTG儲液,用無菌玻棒將溶液涂勻,置于37℃下放置3-4 小時,使培養基外表
的液體完全被吸收，備用。
四、實驗步驟
〔一〕大腸桿菌感受態細胞制備
1、將受體大腸桿菌接種于LB斜面上活化，置于恒溫培養箱中37℃培養過夜。
2、取一環上述大腸桿菌培養物菌落接種于3 毫升LB試管中，于恒溫振蕩器上，37℃振蕩培養過夜〔約16 小時〕，必要時在顯微鏡下鏡檢菌細胞是否形態一致，有無雜菌污染。
3、用移液管無菌條件下，取過夜培養液1 毫升，接種于新鮮的LB 中〔100毫升LB/250毫升三角瓶，接種量按菌液濃度而定，一般在1%左右〕，于恒溫振蕩器上37℃培養2―3 小時。
4、取1 毫升培養液以未接種的LB 作空白對照，在751 分光光度計上測OD550 的光密度值，約為0.2―0.5 左右。
5.無菌條件下將上述1 毫升菌液倒入1.5毫升EP 離心管中〔離心管應帶蓋并高壓滅菌過〕，
每組2 支。
