陶瓷羥基磷灰石（CHT）原理與技術
一、分離機理：羥基磷灰石具有獨特的分離機理，是唯一直接用于蛋白質和核酸純化的無機層析填料，高度耐堿，生
物安全性最高。其中PO43－離子與帶正電的蛋白質以離子鍵結合，具有離子交換特性，可由NaCl濃度梯度或磷酸鈉濃度梯度 洗脫，其中的Ca2＋離子與帶負電蛋白質的自由羧基以金屬螯合方式結合，該結合方式對NaCl不敏感，可由磷酸鈉濃度梯度 洗脫。因此該填料既可以用磷酸鈉單梯度洗脫，也可以采用NaCl梯度洗脫后以低濃度磷酸鈉緩沖液平衡，再以磷酸鈉濃度 梯度洗脫的雙梯度洗脫模型，以達到更高的分辨率。
二、羥基磷灰石類型選擇：羥基磷灰石因陶瓷化工藝不同分為 2 種類型：I 型和 II 型，I 型對蛋白質具有更大的保
留，對普通蛋白質具有更大的動態載量，主要純化大部分蛋白質（分子量一般在 100kd 一下） 型由于孔徑較 I 型大，因 ；II 而對抗體和部分重組疫苗等大分子量蛋白質的動態載量更高，而對 HSA 幾乎無保留，因而更適合于抗體的純化，同時 II 型 對核酸具有更大的保留，能夠分辯單、雙鏈、是否超螺旋等各種高級結構的核酸，因而也適合純化核酸。
三、 羥基磷灰石的分離策略： 由于羥基磷灰石層析的上樣對 NaCl 不敏感， 更適合作為中間純化和精純的常規步驟，
經第一步離子交換捕獲得到的樣品不需作任何脫鹽處理即可直接上樣純化， 具有更高的分辨率。 因此， 陶瓷羥基磷灰石 （CHT） 更多的是用于蛋白質分離純化的中間步驟，一般第一步用離子交換或親和捕獲得到的組分即可直接上樣到 CHT 層析柱上， 可進行高分辨率的分離，獲得高純度的組分。 層析條件的摸索參數主要有：型號，磷酸鹽緩沖液的不同 pH，單梯度，雙梯度等等。
雙梯度洗脫模型
不同類型 CHT 陶瓷羥基磷灰石在不同 pH 下不同蛋白質的保留時間（min）
四、CHT 羥基磷灰石層析初始條件設定與條件摸索
羥基磷灰石最常用的緩沖液是磷酸鈉緩沖液，也可用磷酸鉀緩沖液，所有梯度洗脫體積一般為 10－20 個柱床體積，一 般起始條件如下： 1、 單梯度洗脫： 平衡液（A 液） ：5mM PB， pH 條件摸索：6.0、6.5、 7.0、7.5、8.0 或以上 洗脫液（B 液） ：400mM PB，
梯度一般為 0——30％B、50％B、70％B、100％B 等。 可在單梯度緩沖液（A 液和 B 液）中加入低濃度 NaCl 已優化分離效果，主要作用是用 Na 離子封閉 CHT 骨架上 的磷酸根離子， 避免帶負電蛋
白質與骨架上的磷酸根離子排斥而影響載量， 所以加入一定濃度的 NaCl 有利于提高 帶負電蛋白質在 CHT 上的載量，一般加入到 20－50mM 的 NaCl。 2、雙梯度洗脫： 平衡液（A 液） ：5mM PB， pH 7.0、7.5、8.0 洗脫液 I（BI 液） 液含 1M NaCl，梯度可從 0——50％B， ：A 洗脫液 II（BII 液） ：400mM PB，梯度一般為 0——30％B、50％B、70％B、100％B 等 3、CHT 的再生和清洗： CHT 是唯一用于蛋白質純化的無機填料，所以高度耐堿，一般的再生和清洗方法如下： 再生：500mM 磷酸鈉緩沖液或 400mM 磷酸三鈉溶液，3－5CV，重新平衡即可。 在位清洗和消毒：1－2M NaOH 或 KOH 溶液，3－5CV 在位清洗。 保存：0.1-1M NaOH 或 20％乙醇，可在位長期保存。
五、應用實例
1、CHT-I 純化重組 α1-抗胰蛋白酶（α1-AT）
圖 1 CHT-I 柱純化 α1-AT。柱尺寸：7×52mm(10ml)；上樣量：5.0ml；Buffer A：10mM 磷酸鈉緩沖液（pH7.0） ；Buffer B： 400mM 磷酸鈉緩沖液（pH7.0） ；梯度：0-5%B 和 5-30%B 各 5 個柱體積，30-100%B 10 個柱體積；流速：2.5 ml/min。分部收 集組分為 1.5ml，收集如下：收集組分 I-VIII 分別為：運行組分（圖上方軸）12-17、23-24、42-49、49-50、51-53、54-58、 69-71 和 74-77。綠條框指示為 α1-AT 洗脫液。
圖 2 圖 1 中收集組分的 SDS-PAGE 結果。泳道 1：標準（從上到下，203、118、86、51.6、34.1、2
9、19.2、7.5kD） ；泳道 2： 上樣液； 泳道 3-10： 分別為圖 1 中之收集組分 I-VIII 蛋白遷移位置用標準確定 （未示） 分離膠為 15%丙烯酰胺， ， Coomassie 亮藍 R-250 染色
