三氯化鐵分光光度法測定全血膽堿酯酶
原理：在血液膽堿酯酶作用下，乙酰膽堿發生水解；剩余的乙酰膽堿與堿性羥胺反應生成乙酰羥胺，后者在酸性條件下，與三氯化鐵反應生成紅棕色羥肟酸鐵配合物，呈色強度與剩余乙酰膽堿的量成正比，在５２０ｎｍ波長處比色，間接測定血中膽堿酯酶活性。此法最低檢測濃度２.４μmol/L（20μl血樣），測定范圍2.4~1000.0μmol/L。
步驟：1、標準的配制：取6支比色管，分別加入0.0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00ml，7μmol/ml的氯化乙酰膽堿標準溶液，加標準緩沖液（PBS）至1.0ml，各加1.0ml水，配制成乙酰膽堿含量為：0.0、1.4、2.8、4.2、5.6、7.0μmol標準溶液系列。向各管中加入4.0ml堿性羥胺，振搖2min。加2.0ml鹽酸溶液，振搖2min。加2.0ml三氯化鐵溶液，振搖。溶液與520nm處，以第一管為參比，測定吸光度值。以乙酰膽堿含量（μmol）對相應的吸光度值繪制標準曲線。
2、樣品的處理：取4支比色管，分別為1（A,B）和2（A,B），向各管加入0.98mlPBS，20μl血樣。置于37℃水浴中預熱5min。向1和2的A管加入1.0ml乙酰膽堿標準溶液。自加入乙酰膽堿開始計時，在37℃左右（正負0.5℃）準確反應30min，每間隔10min振搖1次，同時，向1
和2的B管加入1.0ml乙酰膽堿標準溶液，充分振搖。取出比色管，各管立即加入4.0ml堿性羥胺溶液，充分振搖2min。然后，A和B管各加2.0ml鹽酸溶液，振搖2min。加2.0ml三氯化鐵溶液，振搖后樣品離心。濾液與520nm處，以標準第一管為參比，測定吸光度。分別用各管吸光度值計算其中乙酰膽堿剩余量，從而得出1,2號管膽堿酯酶活性。
實驗數據及結果：標準曲線吸光度值如下表
表1標準曲線吸光度值
膽堿酯酶溶液體積 | 0 | 1.4 | 2.8 | 4.2 | 5.6 | 7.0 |
吸光度值 | 0.004 | 0.139 | 0.260 | 0.395 | 0.475 | 0.600 |
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可得標準曲線為：y=0.081x+0.028 擬合方程為R2=0.994
樣品吸光度如下表
表2樣品吸光度
| 1號 | 2號 |
A管 | 0.576 | 0.555 |
B管 | 0.643 | 0.656 |
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1A中含有乙酰膽堿的量是6.7654 1B中含有7.5926 消耗乙酰膽堿為0.8272μmol
2A中含有乙酰膽堿的量為6.5061 2B中含有7.7531 消耗乙酰膽堿量為1.247μmol
由此數據可知2號管中乙酰膽堿消耗量大，估1號內乙酰膽堿酶活性被抑制為注射有有機磷農藥的小鼠血樣。
討論：1、此次實驗中可能帶來誤差的地方有標準曲線的配制過程，標準的測定。
2、測定樣品濃度由低到高。如此則可以不需要潤洗比色皿，在日后工作中處理大量樣品時節約時間大有幫助。
3、不規范實驗步驟：此次實驗并沒有嚴格按照實驗步驟要求的標準與樣品同時測定，而是先進行的標準曲線的測定，后進行的樣品測定。
4、此次實驗的影響因素主要有溫度與時間，反應時間不夠則反應無法徹底進行，會影響實驗結果。另外酶活性和溫度也有關系，由于在同等溫度下，故溫度帶來的影響可忽略不計。
