質(zhì)粒圖譜大全

2023年12月4日發(fā)(作者：流行唱法)

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（轉(zhuǎn)載）

一.九種表達載體

Pllp-OmpA, pllp-STII, pMBP-P, pMBP-C,

pET-GST, pET-Trx, pET-His, pET-CKS, pET-DsbA

二.克隆載體

pTZ19RDNA

pUC57DNA

PMD18T

PQE30

pUC18

pUC19

pTrcHisA

pTrxFus

pRSET-A

pRSET-B

pVAX1

PBR322

pbv220

pBluescriptIIKS( )

L4440

pCAMBIA-1301

pMAL-p2X

pGD926

三.PET系列表達載體

ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETDsbFusionSystems39band40b

ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystem33b

ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystems

ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystemsplusCompetentCells

ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETGSTFusionSystems41and42

ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETNusAFusionSystems43.1and44

ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETVectorDNA

ProteinPurification?PurificationSystems?Strep?TactinResinsandPurificationKits

四.PGEX系列表達載體

TEcoR?pGEX-1I/BAP

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pGEX-2T

pGEX-2TK

pGEX-3X

pGEX-4T-1

pGEX-4T-2

pGEX-4T-3

pGEX-5X-1

pGEX-5X-2

pGEX-5X-3

pGEX-6P-1

pGEX-6P-2

pGEX-6P-3

五.PTYBsystem

PTYB1

PTYB2

PTYB11

PTYB12

六.真核表達載體

pCDNA3.1(-)

pCDNA3.1( )

pPICZalphaA

pGAPZαA

PYES2.0

pBI121

pEGFP-N1

pEGFP-C1

pPIC9K

pPIC3.5K

如何閱讀分析質(zhì)粒圖譜

載體主要有病毒和非病毒兩大類,其中質(zhì)粒DNA是一種新的非病毒轉(zhuǎn)基因載體。

一、一個合格質(zhì)粒的組成要素

復(fù)制起始位點Ori?即控制復(fù)制起始的位點。原核生物DNA分子中只有一個復(fù)制起始點。而真核生物DNA分子有多個復(fù)制起始位點。

抗生素抗性基因可以便于加以檢測，如Amp ?,Kan

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多?克隆位點MCS克隆攜帶外源基因片段

P/E?啟動子/增強子

Terms終止信號?

加poly（A）信號?可以起到穩(wěn)定mRNA作用

二、如何閱讀質(zhì)粒圖譜

第一步：首先看Ori的位置，了解質(zhì)粒的類型（原核/真核/穿梭質(zhì)粒）

第二步：再看篩選標(biāo)記，如抗性，決定使用什么篩選標(biāo)記。

（1）Ampr水解β－內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。

（2）tetr可以阻止四環(huán)素進入細(xì)胞。

（3）camr生成氯霉素羥乙酰基衍生物，使之失去毒性。

（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶使G418（長那霉素衍生物）失活

（5）hygr使潮霉素β失活。

第三步：看多克隆位點（MCS）。它具有多個限制酶的單一切點。便于外源基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入，會導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

第四步：再看外源DNA插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA片段。一般來說，外源DNA片段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。

第五步：是否含有表達系統(tǒng)元件，即啟動子－核糖體結(jié)合位點－克隆位點－轉(zhuǎn)錄終止信號。這是用來區(qū)別克隆載體與表達載體。克隆載體中加入一些與表達調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達載體。選用那種載體，還是要以實驗?zāi)康臑闇?zhǔn)繩。

啟動子－核糖體結(jié)合位點－克隆位點－轉(zhuǎn)錄終止信號

啟動子－促進DNA轉(zhuǎn)錄的DNA順序，這個DNA區(qū)域常在基因或操縱子編碼順序的上游，是DNA分子上可以與RNApol特異性結(jié)合并使之開始轉(zhuǎn)錄的部位，但啟動子本身不被轉(zhuǎn)錄。?

增強子/沉默子－為真核?基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強鄰近基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控順序。其作用與增強子所在的位置或方向無關(guān)。即在所調(diào)控基因上游或下游均可發(fā)揮作用。/沉默子－負(fù)增強子，負(fù)調(diào)控序列。

核糖體結(jié)合位點/起始密碼/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖體的兩個結(jié)合位點，對于原核而言是AUG（起始密碼）和SD序列。?

轉(zhuǎn)錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子：結(jié)構(gòu)基因的最后一個外顯子中有一個AATAAA的保守序列，此位點down－stream有一段GT或T富豐區(qū)，這2部分共同構(gòu)成poly（A）加尾信號。結(jié)構(gòu)基因的最后一個外顯子中有一個AATAAA的保守序列，此位點down－stream有一段GT或T富豐區(qū)，這2部分共同構(gòu)成poly（A）加尾信號。?

回答有人之前提出的一個問題：為什么質(zhì)粒圖譜上有的箭頭順時針有的箭頭逆時針，那其實是代表兩條DNA鏈，即質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈DNA，它的啟動子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上.

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三、介紹一下關(guān)于載體的知識（雖然課本上都有寫）

1. 什么是載體

即要把一個有用的基因（目的基因——研究或應(yīng)用基因）通過基因工程手段送到生物細(xì)胞（受體細(xì)胞），需要運載工具（交通工具）攜帶外源基因進入受體細(xì)胞，這種運載工具就叫做載體（vector）。

P.S.基因工程所用的vector實際上是DNA分子，是用來攜帶目的基因片段進入受體細(xì)胞的DNA

2. 載體的分類

―――按功能分成：（1）克隆載體都有一個松弛的復(fù)制子，能帶動外源基因，在宿主細(xì)胞中復(fù)制擴增。它是用來克隆和擴增DNA片段（基因）的載體。（所以有時實驗時擴增效率低下，要注意是不是使用的嚴(yán)謹(jǐn)行載體）

（2）表達載體具有克隆載體的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）還具有轉(zhuǎn)錄/翻譯所必需的DNA順序的載體。

―――按進入受體細(xì)胞類型分：（1）原核載體（2）真核載體（3）穿梭載體（sbuttlevector）指在兩種宿主生物體內(nèi)復(fù)制的載體分子，因而可以運載目的基因（穿梭往返兩種生物之間）.

P.S.穿梭質(zhì)粒含原核和真核生物2個復(fù)制子，以確保兩類細(xì)胞中都能擴增。

3. 基因工程載體的3個特點：

（一）都能獨立自主的復(fù)制：載體DNA分子中有一段不影響它們擴增的非必需區(qū)域，如MCS，插在其中的外源DNA片段，能被動的跟著載體一起復(fù)制/擴增，就像載體的正常成分一樣。

（二）都能便利的加以檢測：如載體的藥物抗性基因，多是抗生素抗性基因，將受體細(xì)胞放在含有該抗生素培養(yǎng)板上培養(yǎng)生長時，只有攜帶這些抗性基因的載體分子的受體細(xì)胞才能存活。

（三）都能容易進入宿主細(xì)胞中去，也易從宿主細(xì)胞中分離純化出來。

4. 載體的選擇和制備：

選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點。如果構(gòu)建的目的是要表達一個特定的基因，則要選擇合適的表達載體。

載體選擇主要考慮下述3點：

【1】構(gòu)建DNA重組體的目的，克隆擴增/表達表達，選擇合適的克隆載體/表達載體。

【2】.載體的類型：

（1）克隆載體的克隆能力－據(jù)克隆片段大小（大選大，小選小）。如<10kb選質(zhì)粒。

（2）表達載體據(jù)受體細(xì)胞類型－原核/真核/穿梭，/哺乳類細(xì)胞表達載體。

（3）對原核表達載體應(yīng)該注意3點：

①選擇合適的啟動子及相應(yīng)的受體菌；

②用于表達真核蛋白質(zhì)時注意克服4個困難和閱讀框錯位；

③表達天然蛋白質(zhì)或融合蛋白作為相應(yīng)載體的參考。

【3】載體MCS中的酶切位點數(shù)與組成方向因載體不同而異，適應(yīng)目的基因與載體易于鏈接，不產(chǎn)生閱讀框架錯位。

選用質(zhì)粒（最常用）做載體的4點要求：

①選分子量小的質(zhì)粒，即小載體（1－1.5kb）→不易損壞，在細(xì)菌里面拷貝數(shù)也多（也有大載體）；

②一般使用松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌里擴增不受約束，一般10個以上的拷貝，而嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒<10.; .

個。

③必需具備一個以上的酶切位點，有選擇的余地；

④必需有易檢測的標(biāo)記，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（試一試）。

無論選用哪種載體，首先都要獲得載體分子，然后采用適當(dāng)?shù)南拗泼笇⑤d體DNA進行切割，獲得分子，以便于與目的基因片段進行連接

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