細胞色素C2

2023年12月8日發(作者：月度總結)

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細胞色素C

摘要

1925年Keilin發現昆蟲的飛翔肌中含有一種色素物質參與氧化還原反應，因這種色素物質有顏色，故命名為細胞色素。細胞色素C是一類以卟啉為輔基的電子傳遞蛋白 ，在呼吸鏈中，依靠鐵的化合價的變化來傳遞電子。細胞色素位于線粒體內膜上，其中常見的細胞色素有五種：Cytb、Cytc、Cytc1、Cyta、Cyta3。線粒體中的細胞色素大部分和內膜緊密結合，只有Cytc結合較松，易于分離純化，結構 較清楚。細胞色素C是一種水溶性蛋白，由核基因編碼，

分子量為12～13kDa，位于線粒體內膜的外側，呼吸鏈復合體Ⅲ～Ⅳ之間，對線粒體能量代謝起重要的調節作用。通常外源性細胞色素C不能進入健康細胞，但在缺氧時，細胞膜的通透性增加，細胞色素C便有可能進入細胞及線粒體內，增強細胞氧化，能提高氧的利用，具有調控細胞能量代謝。細胞色素C在細胞凋亡中的作用，只是近幾年來才引起廣泛關注。從線粒體中泄露出的細胞色素C有誘導細胞凋亡的作用。因此，細胞色素C與眾多的疾病都有關，了解和研究細胞色素C就有助于我們臨床醫藥上的應用有重要的意義，也與我們的息息相關，細胞色素C也是近幾年來眾多學者關注的問題之一。

細胞色素C的結構

細胞色素C，就像在蛋白 質數據編號3cyt中展示的那樣，是一個電子載體。就像很多攜帶電子的蛋白那樣包含著可以攜帶電子的輔基。細胞色素C含有一個鐵原子的血紅素基團，由紅色展示 。由鐵離子和釋放電子。周邊蛋白質為電子提供了良好的環境，使其緊密的結合在細胞色素C上。細胞色素C是一個非常古老的蛋白，在生命起源的早期便已產生。因為這種至關重要的蛋白在細胞 能量的產生中起著關至關重要的作用且千百萬年來它幾乎沒有京華，所以細胞 色素C在酵母的細胞 和我們的細胞中并沒有很大變化。它們中有很多含有細胞色素C，用血紅素和鐵離子來轉運電子，但是周邊蛋白的變化使得它們的作用貌似神離。而其他的載體用另外一些輔基來轉運電子，比方說鐵硫簇（就像鐵硫蛋白那樣），銅離子群（就像細菌氧化還原蛋白和質體藍素那樣）和其余的一些金屬離子。而含細胞色素C的每一分子，都聯接著細胞中的電流，它攜帶電子東奔西走。

細胞色素C(Cytochrome C，Cyt C)是一種含有血紅素的電子轉運蛋白，廣泛存在于動物的需氧組織中，集中分布于動物心肌細胞線粒體內膜的外表面，是細胞呼吸鏈中一個非常重要的電子傳遞體[1]。高等動物的細胞色素C由104個氨基酸殘基的一條肽鏈組成，分子量約為13000，含有19個賴氨酸殘基，等電點在pH10.2~10.8，含鐵量為0.456%，是一種堿性蛋白(結構如圖1)。通常外源性細胞色素C不能進入健康細胞，但在缺氧時，細胞膜通透性增加，細胞色素C有可能進入細胞及線粒體內，增強細胞氧化，提高氧的利用。目前細胞色素C主要用于組織缺氧的急救和輔助用藥，如一氧化碳中毒、催眠藥中毒、新生兒窒息、嚴重休克缺氧、麻醉及肺部疾病引起的呼吸困難、高山缺氧、腦缺氧、心臟疾病引起的缺氧等[2]。

輔酶Q10(Coenzyme Q10)又稱泛醌，是脂溶性醌類化合物,存在于哺乳動物線粒體內膜中，是生物氧化呼吸鏈中的一個不可缺少的分子，它兼有氫遞體和電子傳遞體[3]的雙重作用分子式為C59H90O4,分子質量為863.36(結構如圖2)，溶于乙醇，不溶于水和甲醇。輔酶Q10作為生化藥物用于心血管系統疾病和腫瘤治療[4]。具有提高人體免疫力、增強抗氧化能力、延緩衰老等功能。（細胞色素C與輔酶Q10聯產工藝研究）

迄今發現細胞凋亡主要經過兩條死亡通路川，一條是外源性通路，即由死亡受體及配體系統激發的凋亡信號下傳至啟動性caspa3e一8，然后激活效應性casPa蛋白酶而引發細胞凋亡;另一通路稱為內源性通路，細胞損傷后線粒體功能障礙，膜通透性改變，凋亡蛋白包括細胞色素C(cytoomeC，cytoc)，Apaf一l及smac/DIABLO等從線粒體釋放到胞漿，casPa一9與之形成凋亡體(aPposome)并被激活，隨之引起caspa瀑布式活化和細胞死亡。（細胞色素C尿細凋亡作用）

摘 要:細胞凋亡是動植物最基本的生命活動,是一個有一系列酶參與的,并且由基因控制的主動的、高度有序的死

亡過程。線粒體除了為細胞提供能量外,在細胞凋亡中也起著中心調控作用。研究發現,線粒體釋放的細胞色素C

是細胞凋亡過程的關鍵因素,已是近些年研究的熱點。本文就細胞色素C從線粒體釋放的機制及在凋亡中的作用進

行綜述。

關鍵詞:細胞凋亡;細胞色素C;線粒體

1 細胞凋亡與線粒體

細胞凋亡(Apoptosis),又稱細胞程序性死亡(Pro-grammed CellDeath,PCD),是指細胞在一定的生理或病理條件下,遵循自身的程序,自己結束其生命的過程。PCD是動植物最基本的生命活動[1]。Kerr等[2]最早提出細胞凋亡(Apoptosis)一詞是取義于希臘詞(apo=from, ptosis=falling),用來描述植物葉片的脫落。在植物的發育途徑中,PCD具有多種重要的功能:如木質部的發生,多年木材的形成,葉的脫落,自交不親和性,對多種病原菌侵蝕及逆境的防御反應等[3]。長期以來,線粒體一直被公認為是細胞內的能量加工廠,其主要作用是為細胞的各種生命活動提供所需的能量。近些年的研究表明,線粒體在細胞凋亡中也起著中心調控作用,在某種意義上,線粒體可以決定細胞的生存或死亡[4-5]。研究發現,線粒體細胞色素C(Cyt-C)、Smac/DIABLO蛋白以及凋亡誘導因子(AIF)等可以通過激活caspas通路導致細胞凋亡,或直接作用于細胞核引起細胞凋亡。Cyt-C是哺乳動物細胞凋亡信號傳導過程的關鍵因素,關于Cyt-C釋放的研究是目前的研究熱點。

2 細胞色素c的結構與功能

Cyt- C是線粒體呼吸鏈(mitocho ndrial respiratochain,MRC)中傳遞電子的載體。無活性前體分子在胞漿內合成的前Cyt-C (一種核基因編碼的水溶性蛋白,相對分子質量為12~13 kDa )。電子在轉運的過程中,伴隨著質子從基質被泵到線粒體膜間隙,從而建立線粒體跨膜電位(Δψm)。當質子從線粒體膜間隙返流回基質中,使另一個蛋白復合分子FO Fl-ATP酶產生ATP。所有這些過程必須有序地進行。如果Cyt-C缺失或其功能障礙將會導致線粒體呼吸鏈出現功能異常,結果ATP缺乏,使細胞死亡。在多種細胞死亡模型中Cyt-C從線粒體釋放至胞質是引發凋亡的關鍵步驟。釋放到細胞漿的Cyt-C在dATP存在下,與凋亡相關因子1 (Apaf - 1)、procaspa- 9結合成凋亡小體( apoptosome ),激活caspa - 9,活化的caspa - 9再激活其他caspas如caspa - 3,從而誘導細胞凋亡。Cyt-C能激活caspas,活性的caspas亦能促進Cyt-C從線粒體釋放,提示線粒體存在caspas底物,該底物的降解又加快了Cyt-C的釋放。Liu等[6]在試圖純化一種體外激活caspa所需的成分時提取出包含Cyt-C的組分。在無細胞(cell-free)模型系統中,Cyt-C可激活caspa-3,從而觸發了細胞凋亡。此外,在無細胞模型系統和完整細胞中, Bcl-2或Bcl-xL的表達均可阻斷Cyt-C從線粒體內釋放,從而抑制caspa-3活化和細胞凋亡。鋁誘導的老年兔海馬中的Cyt-C從線粒體釋放入胞質是凋亡的關鍵性步驟[7]。近來有研究表明,在植物細胞PCD初期也檢測到線粒體中細胞色素c蛋白向細胞質中的釋放[8],外源Cyt-C蛋白處理可誘導胡蘿卜和煙草原生質體發生PCD。3 Cyt-C在線粒體中的釋放和作用機制大量研究表明,在凋亡初期Cyt-C可以從線粒體內膜釋放,從而啟動線粒體的凋亡機制[13]。Cyt-C從線粒體釋放的機理尚未完全闡明,但一般認為有以下2種途徑。一是通過線粒體滲透轉運孔(mitochondrial permeabili-ty transitio n pore, MPTP),這往往伴隨著線粒體膜的去極化。MPTP是由內膜上的蛋白ANT ( adenine nucleotidetransporte r)、線粒體基質中的親環素D ( cyclophilinD )及外膜的孔蛋白-電位依賴型陰離子通道( voltage depend-entanion

channe ,l VDAC )構成[ 9 ]。正常的細胞中,這3種蛋白質與抗凋亡家族成員Bcl-2與Bcl-xl協同作用,維持線粒體正常的生理功能[10]。在病理條件下,如氧自由基、pH值的改變都能引起開放的孔徑明顯增大,引起外膜破壞并最終導致Cyt-C從線粒體釋放[11]。

二是其他的電壓依從性離子通道( vol tage-depend-entanion channel,VDAC)的關閉也可引起線粒體的超極化。在一些凋亡刺激因素的作用下,VDAC的關閉使得ATP/ADP交換障礙,導致FoF1-ATP酶活性抑制,ATP生成減少和質子跨膜轉運功能降低,并最終阻礙了H+重新進入線粒體基質,基質內負電荷大大增加,于是線粒體內膜發生超極化,Δψm的增加,引起線粒體滲透性擴張,最后使得Cyt-C釋放。Azoulay zohar等[12]指出HK-I直

接與VDAC結合,誘導了這種轉運質子、核苷酸和其他物質通道的關閉,因而阻止了Cyt-C的釋放和細胞的凋亡。還有證據表明,VDAC的過度關閉會導致線粒體流動和細胞凋亡[13]。Kmi等證實了Hxk1(編碼一種線粒體的己糖激酶)通過保持線粒體膜的完整性而阻止了Cyt-C的釋放,抑制了細胞凋亡[14]。

細胞凋亡的調控是一種復雜的多水平的調控,多因素相互作用促進或抑制凋亡的發生。Cyt-C透過線粒體膜的機制尚未得到普遍承認,到底是MPTP引起Cyt-C的釋放,還是Cyt-C的釋放導致線粒體滲透轉運,還有待進一步的證實。Cyt-C的釋放與細胞凋亡因子分子水平的相互作用機制還不清楚。隨著對線粒體Cyt-C的結構、功能及其基因學研究和PCD分子生物學研究的不斷深入,這些問題會逐步變得更清楚。

（細胞凋亡與細胞色素C）

研究表明細胞色素C從線粒體釋放是細胞凋亡的關鍵步驟[1]。線粒體是所有真核細胞內腺苷三磷酸(ATP)的產生中心，對維持細胞能量代謝和正常功能活動起重要作用。研究發現，線粒體內包含一些與細胞凋亡有密切關系的物質，如細胞色素C(CytC)、凋亡誘導因子(apoptosis inducingfactor，A IF)、Ca2+和活性氧自由基(reactive oxygn spe-cies，ROS)等。在凋亡信號的刺激下，線粒體膜通透性增加，由此引發線粒體產生一系列關鍵性變化，包括線粒體透性轉換孔(mitochondrial permeability tran-sition pore，MPTP)的開放、CytC的釋放、線粒體跨膜電位(mitochondrial transmembrane potential，用△ψm表示)的下降、A IF等凋亡因子的釋放、Bcl基因家族成員的介入等。不同信號的傳導最終集中到線粒體上激活或抑制這些事件的發生，再經相應的信號傳導通路調控細胞凋亡[2]。

3線粒體中凋亡因子的調控

3.1細胞色素C

細胞色素C是線粒體呼吸鏈的重要組成部分，它是由兩個無活性的前體分子合成的：前細胞色素C（該蛋白質由細胞核基因編碼，然后被轉運至線粒體）和亞鐵血紅素（由線粒體合成）[14]。由于細胞色素C具有亞鐵血紅素基團，它可以在呼吸鏈復合酶Ⅲ(細胞色素還原酶)和IV(細胞色素氧化酶)之間傳遞電子。細胞色素C缺乏時，電子傳遞鏈被阻斷，將導致兩方面的后果：ATP合成減少及不完全氧化造成的超氧陰離子(ROS)過度生成，而ROS是誘導凋亡的重要因素。

研究表明細胞色素C從線粒體釋放是細胞凋亡的關鍵步驟。釋放到細胞質中的細胞色素C在dATP存在的條件下能與凋亡蛋白酶活化因子1(apoptosis protea activating factor 1，Apaf-1)結合，使其形成多聚體，并促使半胱天冬蛋白酶與其結合形成凋亡小體(apoptosome)，現已能確定半胱天冬蛋白酶即Caspa在凋亡過程中是起著必不可少的作用。細胞凋亡的過程實際上是Caspa不可逆有限水解底物的級聯放大反應過程，目前，至少有10多種Caspa被發現，Caspa分子間的同源性很高，結構相似，都是半胱氨酸家族蛋白酶，根據功能可把Caspa基本分為2類：一類參與細胞的加工；另一類參與細胞凋亡。Caspa家族一般以酶原的形式存在，并具有半胱氨酸激活位點和底物裂解位點。細胞色素C在dATP存在的條件下與凋亡蛋白酶活化因子1(apop tosis p rotea activatingfactor 1，Apaf-1)結合形成的多聚體主要與caspa-9結合形成凋亡小體。其結果是caspa-9被激活，激活的caspa9能夠激活其他的caspa，如caspa-3等，從而誘導凋亡[15]。

（線粒體調控細胞凋亡的研究進展）

1、COX的分子生物學研究

COX即呼吸鏈復合體酶Ⅳ,是線粒體氧化呼吸的限速酶,相對分子量為166 kD。COX直接參與線粒體氧的利用和能量產生,主要功能是將電子從細胞色素C傳遞給O2分子,每傳遞一對電子,要從線粒體基質中攝取4個質子,其中兩個質子用于水的形成,另兩個質子被跨膜轉運到膜間隙。COX的損傷將直接影響線粒體功能,導致能量產生受阻、呼吸鏈大量產生自由基。由于COX在能量產生和調節中的重要地位,自它發現以來一直是生物研究領域中重要的研究課題,也是相關疾病研究的理想靶標。COX是細胞核DNA與線粒體DNA分別編碼的亞基共同組成的復雜復合物。真核細胞中COX是存在于線粒體內膜上的一種跨膜整合蛋白。哺乳動物COX每個單體由13個亞基組成,其中最大3個亞基(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)由線粒體DNA編碼,構成級聯反應的核心,序列高度保守〔1~3〕。COXⅠ亞基基因約1 544 bp,與血紅素a、血紅素a3、銅離子(CuB)結合。COXⅡ亞基基因約683 bp,含雙合銅離子(CuA)構成的雙核中心,攜帶有細胞色素C的結合位點,位于線粒體胞質面與細胞色素C進行反應。COXⅢ亞基基因約783 bp,可能參與氧化還原連接的質子易位過程。其余10個亞基(Ⅳ、Va、Vb、Ⅵa、Ⅵb、Ⅵc、Ⅶa、Ⅶb、Ⅶc和Ⅷ)由核DNA編碼,基因分別定位于9條不同的染色體上,在胞漿中翻譯后轉運至線粒體參與裝配,具有明顯的器官和種族特異性。COXⅣ亞基在COX酶復合體組裝過程中起著重要作用。核DNA編碼亞基功能尚未完全明確,可能主要起調節和穩定作用。COX亞基的表達還需要某些輔助因子如活化因子等參與,表達調控可以在轉錄前、轉錄、翻譯等多種水平進行。多種因素會影響COX亞基的表達和組裝,例如分子伴侶、激素水平以及O2、NO、鐵、心磷脂、腺苷酸濃度等〔3~6〕。COX作用的詳細機制尚未完全明了。Sampson等〔7〕利用計算機模擬酶和底物的相互作用,并確定參與反應的基團,結果顯示鹽鍵和氫鍵對酶-底物復合物的形成和穩定有

（細胞色素C氧化酶與神經疾病研究現狀）

細胞色素是定位于線粒體內膜外側的一個血紅素蛋白它存在于所有含線粒體呼吸鏈的生物體內,即從細菌、海藻、酵母、昆蟲、無脊椎動物、脊椎動物到哺乳動物等原核生物和真核生物中都有[1]。Cytc是呼吸鏈中一個重要的電子載體,通過血紅素輔基(heme)中心鐵離子價態的變化在細胞色素c還原酶(cytochromecreducta)和細胞色素c氧化酶(cytochromecoxida)之間傳遞電子[2]除了行使電子傳遞功能外,近十幾年來的研究還發現Cytc在細胞凋亡(apoptosis)[3, 4]和抗氧化[5]方面也起著重要作用。從結構上看,Cytc分子形狀近似于球形,直經約為3·4 nm,是一個高度離子化的分子。Cytc蛋白分子的氨基酸序列和三維空間結構都已經得到闡明,是了解得最透徹的一個細胞色素蛋

白[6]。以馬心細胞色素c(hor heart cytochromec)為例,它的全蛋白是由一條含有104個氨基酸殘基的肽鏈和一個與之共價相連的血紅素輔基(heme)組成,其晶體結構如圖1所示(蛋白質數據庫PDB編碼為1HRC[7])。輔基heme位于Cytc的中心,外圍一條肽鏈, heme被肽鏈緊緊地包裹著,僅有一裂縫使血紅素的部分邊緣與溶液相接觸,該裂縫的面積僅占整個分子面積的0·06%,此區域被認為是分子反應活性區域。Cytc分子的二級結構主要有5個α-螺旋(N-端和C-端的兩個螺旋和中間的3個螺旋),分別對應于Val3-Lys13 (H1)、Asp50-Asn54 (H2)、Glu61-Glu69 (H3)、Pro71-Tyr74 (H4)和Lys88

Thr102 (H5)。在Cytc中, heme與肽鏈的結合除了氫鍵、疏水相互作用以及heme與其軸向配體組氨酸(His18)和甲硫氨酸(Met80)的配位作用外, heme的2-、4-位上的兩個乙烯基還通過與蛋白肽鏈上第14和1位的兩個半光氨酸(Cys14 and Cys17)形成兩個硫醚鍵而和肽鏈共價相連(Cytc蛋白肽鏈氨基酸序列的編碼以馬心細胞色素c為參考),如圖2所示。正因為如此, Cytc是一個很穩定的蛋白分子,在中度變性條件下His18仍然與heme配位[8]。

由于Cytc蛋白可溶于水,易于純化,性質穩定,且三維結構已知,因此對Cytc蛋白進行氨基酸殘基突變的研究很多。具有代表性的突變位點包括輔基heme的軸向配體His18及Met80、heme疏水腔內的Tyr67、表面氨基酸殘基Phe82以及與heme共價相連的Cys14及Cys17等。研究方法包括用基因定點突變(site-directedmutagenesis)方法進行的天然氨基酸突變以及用半合成(misynthesis)方法進行的非天然氨基酸置換等。

（細胞色素c突變研究進展）

細胞色素c(Cytc)是一種含有血紅素的金屬蛋白,廣泛存在于含線粒體呼吸鏈的生物體內[1]。Cytc是呼吸鏈中一個重要的電子載體,它的主要功能是通過血紅素輔基(heme)中心鐵離子價態的變化在細胞色素c還原酶(cytochrome c reducta)和細胞色素c氧化酶(cytochrome c

oxida)之間傳遞電子[2-4]。此外,近十幾年來的研究還發現Cytc在誘導細胞凋亡(apoptosis)[5-8]和抗氧化[9]中也起著重要的作用。在Cytc中,血紅素輔基heme與軸向配體甲硫氨酸和組氨酸形成配位鍵外,還通過2-,4-位的乙烯基和蛋白肽鏈上的兩個半光氨酸形成兩個硫醚鍵和肽鏈共價相連,因而Cytc的性質很穩定。作為血紅素類蛋白的典型代表,Cytc還具有分子量小(約1. 3 kDa)、水溶性好、結構穩定、蛋白易于純化及三維結構已知等優點。因此,Cytc一直是血紅素類蛋白結構-性質-功能關系研究及結構-功能轉換研究的良好分子模型。

馬心細胞色素c(Hor heartCytc)是Cytc家族中的一員,是最早確定出氨基酸序列的Cytc蛋白[10, 11],它的全蛋白是由一條含有104個氨基酸殘基的肽鏈和一個與之共價相連的血紅素輔基組成。Cytc分子的二級結構主要有5個α螺旋(以H1-H5表示),包括N-端和C-端的兩個螺旋和中間的3個螺旋,其三維結構如圖1所示(蛋白質數據庫PDB編碼為1HRC[12])。

來源于不同物種的Cyt c有著相似的空間結構和生物功能,它們之間性質的差別(包括氧化還原電位及化學穩定性等)主要取決于一些特定部位的、尤其是一些高度保守的氨基酸之間的不同。這些特定部位的氨基酸殘基是如何影響和調控蛋白的結構、性質和功能,長期以來一直是化學生物學和蛋白質化學的重點研究領域[13-17]。

（細胞色素c蛋白序列分析與結構比較）

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