細胞色素C的提取

2023年12月8日發(作者：狂人日記全文)

-

細胞色素C的提取

實驗一、細胞色素C的制備和測定

摘要：細胞色素C為含鐵卟啉的結合蛋白質，包括多種能夠傳遞電子的含鐵蛋白質。廣泛存在于各種動植物組織和微生物中。

它是呼吸鏈中極重要的電子傳遞體。細胞色素C是一種細胞呼吸激活劑。在臨床上可以糾正由于細胞呼吸障礙引起的一系列缺

氧癥狀，使其物質代謝、細胞呼吸恢復正常，病情得到緩解或痊愈。在自然界中，細胞色素C存在于一切生物細胞里，其含量

與組織的活動強度成正比。本實驗以新鮮牛心為材料提取、制備和純化細胞色素C，得到其粗品溶液，并進行含量測定。

關鍵詞：細胞色素C 提取制備純化含量測定

1、原理：

細胞色素C包括多種能夠傳遞電子的含鐵蛋白質總稱。廣泛存在于各種動植物組織和微生物中。它是呼吸鏈中極重要的電子傳

遞體，細胞色素C （cytochrome c，CytC）只是細胞色素的一種。它在呼吸鏈上位于細胞色素還原酶和細胞色素氧化酶之

間。線粒體中的細胞色素絕大部分與內膜緊密結合，僅有細胞色素C結合輕松，較易被分離純化。

細胞色素C為含鐵卟啉的結合蛋白質，每個細胞色素C分子含有一個血紅素和一條多肽鏈。分子質量約為13000，蛋白質部分

由104個左右的氨基酸殘基組成，其中賴氨酸含量較高，等電點10.2-10.8，含鐵量0.37-0.43%。它易溶于水，在酸性溶液中溶

解度更大，故可用酸性水溶液提取。細胞色素C的傳遞電子作用是由于細胞色素C中的鐵原子可以進行可逆的氧化和還原反

應，故可分為氧化性和還原性，前者水溶液呈深紅色，后者水溶液呈桃紅色。細胞色素C對熱，酸和堿都比較穩定，但三氯乙

酸和乙酸可使之變性，引起某些失活。

細胞色素C是一種細胞呼吸激活劑。在臨床上可以糾正由于細胞呼吸障礙引起的一系列缺氧癥狀，使其物質代謝、細胞呼吸恢

復正常，病情得到緩解或痊愈。在自然界中，細胞色素C存在于一切生物細胞里，其含量與組織的活動強度成正比。本實驗以

新鮮豬心為材料提取制備和純化細胞色素C，得到其粗品溶液，方法簡單易操作。

2 試驗材料和方法

2.1 材料：

新鮮（冷凍）豬心樣品。

2.2 試劑

①1mol/L H2SO4 （55.5mL/L）：500mL

②1mol/L NH4OH（67.6mL/L）：500mL

③12%BaCl2：250mL

④25%(NH4)2SO4：500mL

⑤0.2% NaCl：500mL

⑥20% 三氯乙酸（TCA）：100mL

⑦人造沸石：白色顆粒，40-60目

⑧聯二亞硫酸鈉

⑨細胞色素C標準液（3mg/ml）

2.3 儀器：

①絞肉機

②電磁攪拌器

③離心機

④分光光度計

⑤透析袋等

2.4 實驗方法：2.4.1 材料處理

新鮮或冷凍豬心，除盡脂肪、血管和韌帶，洗盡積血，切成小快，放入絞肉機中絞碎（兩遍）。

2.4.2 細胞色素C粗品制備

2.4.2.1 提取：

稱取豬心碎肉200克，加自來水300毫升酸化水（水預先用6~8毫升，1mol/L 的硫酸酸化）。用電磁攪拌器攪拌提取，再用

1mol/L的硫酸調PH=4.0（需要不斷調整），攪拌提取1.5小時。用1mol/L的氨水調PH=6.0，停止攪拌。四層紗布擠壓過濾，

收集濾液。

2.4.2.2 中和：

用1mol/L的氨水調濾液PH=7.2-7.5，利用等電點沉淀雜蛋白，靜置20~30分鐘，使沉淀沉下。虹吸上部清夜，過濾除雜質，下

部渾濁液離心（3000rpm,15min）。合并得到的紅色清夜，測量體積。

2.4.2.3 吸附：

每人稱取人造沸石4g，加水攪拌，除去12s內不下沉的細顆粒。向柱內加去離子水至1/2體積，然后邊攪拌邊連續、均勻地將

預處理好的人造沸石水溶液裝填入柱，避免柱內出現氣泡。裝柱完畢，打開柱下端夾子，使柱內沸石面上剩下一薄層水。

將中和好的澄清濾液小心加到沸石上面，勿沖動沸石，使之流入柱內進行吸附，控制流出液的速度不超過10ml/min。隨著細

胞色素C被吸附，人造沸石由白色變為紅色，流出液應為淡黃色或微紅色。

2.4.2.4 洗脫

吸附完畢，可在柱內洗滌：依次用30ml自來水、去離子水、0.2%氯化鈉溶液、去離子水洗柱。然后用25%硫酸銨溶液洗脫

（流速小于2ml/min），收集紅色洗脫液（洗脫液一旦變白，立即停止收集），測量體積（控制在15ml左右）。洗脫完畢，人

造沸石回收，可再生使用。

2.4.2.5 鹽析

為了進一步提純細胞色素C，向洗脫液中緩慢加入固體硫酸銨，邊加邊攪拌，使硫酸銨溶液濃度為45%（約相當于67%的飽和

度，即100ml洗脫液加17g硫酸銨），放置過夜，雜蛋白沉淀析出，過濾，收集紅色透亮的細胞色素C濾液，測量體積。

2.4.2.6 TCA 沉淀

按8%體積滴加20%TCA，邊加邊攪拌。此時細胞色素帶正電荷，與其結合生成可逆沉淀析出，立即離心

（3000rpm，15min）,收集沉淀（若上清液仍為紅色，倒出后再補加5%體積的TCA，再次離心，收集沉淀）。沉淀用少量去

離子水溶解（體積不超過10mL）。

2.4.2.7透析

溶解液裝入透析袋對自來水（30min）、去離子水（10~20min）透析（用

磁力攪拌器攪拌），用BaCL2 檢測袋周圍水的

2

4

SO（用試管收集流下來的

透析液約1ml ，滴加1-2滴BaCL2試劑至試管中。搖勻若無白色沉淀，表示透析完全）。過濾除去不溶物質，得到細胞色素C

的粗品液，量體積，測定其含量。

3 結果與分析

以細胞色素C 的濃度（mg/ml ）為橫坐標，以吸光度A520nm 為縱坐標制作標準曲線，按表1繪制細胞色素C 含量的標準曲線

(圖1)，從標準曲線上按公式：

圖1 細胞色素C 標準曲線

C

C 色素= =0.1346（mg/ml ）

注意事項：

(1) 酸水提取時，由于組織液的釋出使pH 上升，因此需不斷調整pH 直至穩定在pH3.5-4.0。

(2) 為使細胞色素C充分被沸石柱吸附，吸附時流速應該慢些。洗脫時同樣控制流速慢些，使細胞色素C在比較少體積內被充分

洗脫出來。

(3) 鹽析時需加入粉末狀硫酸銨，并且邊加邊攪拌，切忌一下子到進去，造成局部濃度過大使細胞色素C被鹽析。

(4) 三氯乙酸是一種蛋白變性劑，可使蛋白質變性沉淀。要通過控制三氯乙酸的濃度和作用時間，使其產生的是可逆沉淀，達

到進一步純化作用。因此必須要逐滴加入三氯乙酸，攪勻后盡快離心，避免局部酸濃度過大和接觸時間過長，產生細胞色素C

不可逆變性沉淀造成損失。

(5) 透析脫鹽是利用細胞色素C分子較大，不能通過一定截留值的半透膜，而其中的鹽分由于分子較小，濃度很高，容易透過

半透膜從高濃度向低濃度的水相移動，達到去除效果。并且在透析前一定要檢查透析袋有無滲漏。

(6) 為盡量減少損失，在每個操作過程都要細心，例如過濾用的紗布、濾紙事前一定要用少量水潤濕。

(7) 加入過多還原粉（聯二亞硫酸鈉）會使測定溶液迅速變混濁而無法比色，因此加入量應嚴格控制，并迅速比色。

4 思考題

1、試以細胞色素C的制備為例，總結出蛋白質制備（分離純化）的主要方法，并簡述其原理。

答：（1）透析和超濾：利用大分子不能透過半透膜，而小分子可以穿過半透膜，從而達到分離純化的目的；（2）等電點沉

淀：利用蛋白質在其等電點的溶解度最小，且不同蛋白質的等電點不相同，從而達到分離純化的目的；（3）鹽析：利用蛋白

質在鹽溶液中可產生可逆沉淀而達到分離純化的目的；（4）有機溶劑沉淀（5）電泳（6）親和色譜

2、本實驗應用了哪些基本的生化分離純化的方法？

答：（1）透析；（2）等電點沉淀；（3）鹽析；（4）層析3、有哪些方法可以進行蛋白質脫鹽處理？

答：（1）透析；（2）凝膠過濾

-