-腸激酶酶活及純度檢測-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

2023年12月12日發(fā)(作者：舉世聞名是什么意思)

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GB/TXXXXX—XXXXAA附錄A（規(guī)范性附錄）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳A.1原量SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法的分離原理，是依據(jù)大多數(shù)蛋白質(zhì)都能與陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉（SDS）按重量比結(jié)合成復合物，使蛋白分子所帶的負電荷遠遠超過天然蛋白分子的凈電荷，消除了蛋白分子的電荷效應，使蛋白按分子大小分離。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法主要用于蛋白質(zhì)分子量的測定、蛋白質(zhì)混合組分的分離和蛋白質(zhì)亞基組分的分析等方面。A.2A.2.1A.2.2A.3儀器設備電泳裝置，符合YY/T凝膠薄層掃描儀。試劑除非另有規(guī)定，本方法使所用的試劑均為分析純，水為GB/TA.3.1A液6882規(guī)定的三級水。0087的要求。1.5mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液。稱取三羥甲基氨基甲烷18.15g，加適量水溶解，用鹽酸調(diào)pH值至8.8，加水稀釋至100mL。A.3.2B液N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺溶液（避光保存）。30%丙烯酰胺溶液-0.8%A.3.3C液1%十二烷基硫酸鈉溶液。A.3.4D液10%N，N，N′，N′-四甲基乙二胺。A.3.5E液10%過硫酸銨溶液，臨用前配制。A.3.6F液0.5mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液。稱取三羥甲基氨基甲烷6.05g，加適量水使溶解，用鹽4GB/TXXXXX—XXXX酸調(diào)pH值至6.8，加水稀釋至100mL。A.3.7電極緩沖液稱取三羥甲基氨基甲烷3g、甘氨酸14.4g、十二烷基硫酸鈉lg，加適量水溶解，用鹽酸調(diào)pH值至8.3，加水稀釋至1000mL。A.3.8供試品緩沖液稱取三羥甲基氨基甲烷0.303g、溴酚藍2mg、十二烷基硫酸鈉0.8g，量取鹽酸0.189mL、甘油4mL，加水溶解并稀釋至10mL。該緩沖液用于非還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。如用于還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，則再加β-巰基乙醇2mL。A.3.9固定液稱取三氯醋酸5g，加水200mL溶解后，加甲200mL，再加水至500mL。A.3.10考馬斯亮藍染色液lg，加入甲醇200mL、冰醋酸50mL、水250mL，混勻。稱取考馬斯亮藍R250A.3.11考馬斯亮藍脫色液取甲醇400mL、冰醋酸100mL與水500mL，混勻。A.3.12保存液取冰醋酸75mL，加水至1000mL，搖勻。A.3.13供試品溶液的制備將供試品與供試品緩沖液按3：1的比例混勻，或照各品種項下的規(guī)定制備，除另有規(guī)定外，置水浴中100℃加熱3?5分鐘；對照品/標準品溶液同法操作。A.4A.4.1分析步驟制備分離膠溶液根據(jù)不同分子量的需要，按表D.1制成分離膠溶液，灌入模具內(nèi)至一定髙加水封頂，室溫下聚合（室溫不同，聚合時間不同）。表A.1凝膠種類凝膠濃度A液B液5%42.77.5%44分離膠和濃縮膠配制比例分離膠濃度10%45.412.5%46.715%4817.5%49.41.35濃縮膠濃度4.5%5GB/TXXXXX—XXXX試液/mLC液D液E液F液H2O7.364.883.32.280.881.60.10.11.60.10.11.60.10.11.60.10.11.60.10.11.60.10.10.90.070.072.254.33A.4.2制備濃縮膠溶液待分離膠溶液聚合后，用濾紙吸去上面的水層，再灌入濃縮膠溶液（配方見表1），插入樣品梳，注意避免氣泡出現(xiàn)。A.4.3加樣待濃縮膠溶液聚合后小心拔出樣品梳，將電極緩沖液注滿電泳槽前后槽，在加樣孔中加入供試品溶液與對照品/標準品溶液不超過20μg。A.4.4電泳垂直板電泳：恒壓電泳，初始電壓為80V，進入分離膠時調(diào)至150V?200V，當溴酚藍遷移膠底處，停止電泳?；蚝懔麟娪荆院懔?0mA條件下開始電泳，至供試品溶液進入分離膠后將電流調(diào)至20mA，直至電泳結(jié)束。A.4.5固定與染色考馬斯亮藍法電泳完畢，取出膠片（條），置固定液中30min，取出膠片（條），置染色液中1?2h，用脫色液脫色至凝膠背景透明后保存在保存液中。_________________________________6

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