Waters XBridge XP和 或XBridge Premier BEH色譜柱維護和使用手

2024年2月15日發(作者：大隊委自我介紹)

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維護和使用手冊 ]XBridge XP和XBridge Premier 2.5 μm BEH色譜柱目錄I. 簡介II. 入門指南

a. eCord安裝

b. 色譜柱安裝c. 色譜柱平衡d. 初始柱效測定e. 色譜柱QR碼f. XBridge XP色譜柱 - VanGuard保護柱g. VanGuard FIT保護柱III. 色譜柱使用a. 樣品制備b. pH范圍c. 溶劑d. 壓力e. 溫度IV. 色譜柱清洗、再生和存放

a. 清洗與再生b. 存放V. eCord智能芯片技術

a. 簡介b. 安裝c. 生產信息d. 色譜柱使用信息VI. 其他信息a. 延長ACQUITY BEH色譜柱 使用壽命的技巧b. BEH HILIC色譜柱入門c. BEH Amide色譜柱入門VII. 注意事項I. 簡介非常感謝您選擇Waters? XBridge? XP和/或XBridge Premier

BEH色譜柱。XBridge BEH填料由通過cGMP和ISO 9001認證的工廠使用超純試劑生產。每批XBridge BEH填料均采用酸性、堿性和中性分析物進行了色譜分析測試，并依據窄范圍的技術指標進行質量控制，確保色譜柱具有可重現的理想性能。每根色譜柱都經過單獨測試，并由eCord?智能芯片提供性能色譜圖和批次分析證書。XBridge Premier BEH色譜柱提供帶或不帶VanGuard?完全集成技術[FIT]保護柱兩種規格。VanGuard FIT保護柱專為延長分析柱使用壽命而設計，可防止不需要的樣品基質或顆粒物進入色譜柱，而不會影響分離性能。保護柱可輕松更換，以便恢復分離性能，延長分析柱的使用壽命。此外，XBridge Premier BEH色譜柱采用創新的MaxPeak?高性能表面技術，能夠盡量減少分析物/表面相互作用，避免可能因此造成的樣品損失，從而提高分析物回收率、分析靈敏度和重現性。1

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維護和使用手冊 ]II. 入門指南每根XBridge BEH色譜柱的色譜柱包裝盒或eCord智能芯片中都隨附COA報告和性能測試色譜圖。COA報告為每批填料所特有，包括批號、未鍵合顆粒和鍵合顆粒的分析結果，以及色譜結果和檢測條件。性能測試色譜圖提供每根色譜柱的以下信息：批號、色譜柱序列號、USP正切法柱效、USP拖尾因子、保留因子以及色譜條件。這些數據應妥善保存，以備將來參考。如果無法讀取eCord智能芯片中的信息，可訪問/coa獲取COA報告和性能測試色譜圖。a. eCord安裝（可能并非所有色譜柱配置都適用）eCord智能芯片按鈕專用于ACQUITY? UPLC?和ACQUITY Arc?系統，需要裝在儀器柱溫箱模塊的側面。eCord按鈕經過磁化處理，無需專門定向。有關eCord智能芯片功能的更多信息，請參閱本維護和使用手冊第IV節。b. 色譜柱安裝（帶或不帶VanGuard FIT保護柱）注：在處理XBridge BEH色譜柱和任何化學品之前，請咨詢您的安全主管部門和/或參照當地法規，使用適當的防護裝備。XBridge BEH色譜柱出廠時保存于100%乙腈中。下述步驟給出的流速適用于內徑2.1 mm的色譜柱。1. 灌注泵系統，排出含緩沖液的流動相，然后將色譜柱的入口 端連接至進樣器出口。2. 用100%有機流動相（甲醇或乙腈）沖洗色譜柱，泵流速設置 為0.1 mL/min，并在五分鐘內增加至0.5 mL/min。

3. 當流動相可從色譜柱出口自由流出時，停止液流并將色譜柱

出口連接至檢測器。這能防止空氣進入檢測系統。4. 按照步驟2所述逐漸增加流速。5. 一旦柱壓和基線達到穩定狀態，即可繼續進行下一部分操作。c. 色譜柱平衡在更換為其他流動相系統之前，務必確保流動相的兼容性。請用至少10倍柱體積的流動相平衡色譜柱（色譜柱體積請參見表1）。柱壓恒定時，可認為色譜柱已達到熱平衡。

表1.空色譜柱體積(mL)（乘以10得到沖洗溶劑體積）

內徑色譜柱柱長(mm)

1.0 mm2.1 mm3.0 mm4.6 mm30–0.10.20.3500.040.20.41.01000.080.40.82.01500.120.51.02.5

為了避免流動相緩沖液在色譜柱或系統中發生沉淀，請使用5倍柱體積的水/有機溶劑混合物沖洗色譜柱，其中有機溶劑比例應與所需緩沖流動相中的有機溶劑比例相同或更低。（例如，引入60%甲醇/40%緩沖液流動相之前，應使用60%甲醇水溶液沖洗色譜柱和系統。）對于采用BEH HILIC填料的色譜柱，用50倍柱體積的50:50乙腈:水溶液（含最終濃度為10 mM的緩沖液）進行沖洗。對于采用BEH Amide填料的色譜柱，用50倍柱體積的60:40乙腈:水溶液進行沖洗。首次進樣之前，用20倍柱體積的流動相（初始條件）平衡色譜柱（色譜柱體積請參見表1）。請參閱“BEH HILIC色譜柱入門”或“Amide色譜柱入門”獲取詳細信息。d. 初始柱效測定1. 使用色譜柱之前，需要先進行一次柱效測試。這項測試可能

包括： a. 您所在實驗室常用的測試混合標準品，和/或 b. 色譜柱隨附的“性能測試色譜圖”中所示的混合標準品。注：如果采用(b)項的分析物進行柱效測試，那么您所在實驗 室在等度條件下測得的柱效可能低于沃特世“性能測試色譜圖” 中所示的柱效。這是正常現象。為了盡可能減小系統體積， 沃特世的等度色譜柱測試系統進行了相應的改進。這對于 色譜柱填充質量的考察相當具有挑戰性，確保了出色的填充 柱品質。XBridge XP和XBridge Premier 2.5 μm BEH色譜柱2

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維護和使用手冊 ]這些經過改造的特殊測試系統不再具有商業可行性，方法的靈活性亦受限，只能用于等度色譜柱測試。2. 測定理論塔板數(N)，并定期對比該數值。3. 按預定的時間間隔進行重復測試，跟蹤色譜柱性能隨時間的 變化情況。所得柱效結果可能會有微小差異，這可能是由于 連接質量、運行環境、系統電子設備、試劑質量、色譜柱 條件和操作員技術等方面存在差異所致。e. 色譜柱QR碼色譜柱標簽上的快速參考卡(QR)碼可提供色譜柱專有信息（即色譜柱的唯一標識符 - P/N和序列號），這些信息按照廣泛采行的行業標準進行編碼。1. 可使用任何能掃描QR碼的設備進行掃描（即使用智能手機 和平板電腦的內置攝像頭應用程序進行掃描）。2. QR碼直接鏈接至的色譜柱信息中心。

3. 獲取關于色譜柱的技術信息和專業信息（即COA報告和應用 紀要）。f. XBridge XP色譜柱 - VanGuard保護柱用于XBridge BEH XP色譜柱，將單獨的保護柱套和保護柱可以輕松地連接到色譜柱入口。有關VanGuard產品的更多信息，請訪問

/vanguard。

將3/8英寸扳手置于此處將7/16英寸扳手置于此處將5/16英寸扳手置于此處VanGuardVanGuardHPLC色譜柱保護柱保護柱卡套圖1. VanGuard保護柱、VanGuard保護柱卡套以及分析柱之間的連接。

g. VanGuard FIT保護柱VanGuard FIT保護柱專門設計用于XBridge Premier色譜柱。

對于帶VanGuard FIT保護柱的XBridge Premier色譜柱，可以使用兩個3/8英寸扳手更換VanGuard FIT保護柱。只需用扳手咬合住保護柱和色譜柱末端螺母的平坦部分，然后逆時針方向轉動（見圖1），即可拆下VanGuard FIT保護柱，然后按照優良實驗室規范將其合理棄置。接下來可以使用新的VanGuard FIT保護柱更換棄置的保護柱。沿順時針方向用手擰緊新的保護柱，再用兩個3/8英寸扳手擰緊。正確密封的位置不應超過手擰緊處的1/4圈。用于擰緊保護柱和

色譜柱的平坦部分圖2. 從XBridge Premier VanGuard FIT色譜柱上拆下VanGuard FIT保護柱時，放置3/8英寸扳手的推薦位置。XBridge XP和XBridge Premier 2.5 μm BEH色譜柱3

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維護和使用手冊 ]III. 色譜柱使用為確保XBridge BEH色譜柱始終保持理想性能，請遵循以下原則：

a. 樣品制備1. 樣品中的雜質往往會污染色譜柱。避免污染的方法之一是在 分析之前使用填充有適合填料的Oasis?固相萃取小柱/色譜柱 或Sep-Pak?小柱凈化樣品。如需了解更多信息，請訪問

/sampleprep。2. 為獲得理想峰形和靈敏度，優先選用運行分析時擬用的流動 相或比它更弱的流動相來制備樣品。除非安裝了正己烷/四氫 呋喃兼容性套件，否則不應將丙酮用作樣品溶劑/稀釋劑。3. 如果樣品不溶于流動相，請確保樣品、溶劑和流動相可以 混溶，避免樣品和/或緩沖液產生沉淀。4. 用0.2 μm濾膜過濾樣品，去除顆粒物質。如果用于溶解樣品 的溶劑含有機改性劑（如乙腈、甲醇等），請確保濾膜材料 不溶于該溶劑。有關濾膜的溶劑相容性問題，請咨詢濾膜生 產商。或者，可以考慮在8000 rpm下離心樣品溶液20 min， 然后將上清液轉移至適當的樣品瓶中。5. 對于親水作用色譜(HILIC)分離，樣品必須用高百分比的有機 溶劑制備（如，95%乙腈）。請參閱“BEH HILIC色譜柱入門” 或“Amide色譜柱入門”章節獲取詳細信息。

b. pH范圍XBridge BEH色譜柱的推薦操作pH范圍如下：采用BEH C18、BEH C8和BEH苯基填料為1~12；采用BEH Shield RP18和BEH

Amide填料為2~11；采用BEH HILIC填料為1~9。表2中列出了常用的緩沖液和添加劑。此外，色譜柱使用壽命將根據運行溫度、使用的緩沖液類型和濃度而有所不同。例如，在高溫下使用pH值為8的磷酸鹽緩沖液會縮短色譜柱使用壽命。c. 溶劑

為了保持理想的色譜柱性能，請使用優質的色譜級溶劑。所有

水相緩沖液在使用前都應使用0.2 μm濾膜過濾。推薦使用Pall

Gelman Laboratory Acrodisc?過濾器。含有懸浮顆粒物的溶劑常會堵塞色譜柱入口分配篩板的外表面，這會導致操作壓力增大，性能變差。有關詳細信息，請參閱第VI節。c. 壓力1. 內徑2.1 mm。XBridge XP和XBridge Premier 2.5 μm色譜柱可 承受的操作壓力上限為18,000 psi（1241 bar或124 MPa）。2. 內徑3.0 mm。XBridge XP色譜柱可承受的操作壓力上限為 18,000 psi（1241 bar或124 MPa）。3. 內徑4.6 mm。XBridge XP和XBridge Premier 2.5 μm色譜柱 可承受的操作壓力上限為10,000 psi（700 bar或70 MPa）。注：在壓力、pH和/或溫度的極值下運行會縮短色譜柱使用壽命。e. 溫度為了改善選擇性、降低溶劑粘度和提高傳質速率，XBridge BEH色譜柱的推薦操作溫度范圍為20~90 ?C。在高pH條件下操作時，建議降低操作溫度以延長色譜柱使用壽命。在較高溫度（如，> 70 ?C）下運行時也可能會導致色譜柱使用壽命縮短。在HILIC分析中，BEH Amide色譜柱可以在高pH值和高溫條件下使用，不會出現問題（請參閱“BEH Amide色譜柱入門”章節的推薦條件）。XBridge XP和XBridge Premier 2.5 μm BEH色譜柱4

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維護和使用手冊 ]表2.使用XBridge BEH色譜柱時的推薦緩沖液添加劑/緩沖液TFA醋酸甲酸醋酸鹽(NH4CH3CO2)甲酸鹽(NH4HCO2)磷酸鹽1磷酸鹽2磷酸鹽34-甲基嗎啡啉氨水(NH4OH)碳酸氫銨

pKa0.34.763.754.763.752.157.212.3~8.49.210.3 (HCO3-)9.2 (NH4+)（醋酸）銨（甲酸）銨硼酸鹽CAPSO甘氨酸1-哌可啉CAPS三乙胺

（用作醋酸鹽）吡咯烷9.29.29.29.72.4, 9.810.210.4緩沖

范圍———3.76–5.762.75–4.751.15–3.156.20–8.2011.3–13.37.4–9.48.2–10.28.2–11.38.2–10.28.2–10.28.2–10.28.7–10.78.8–10.89.3–11.39.5–11.5揮發性

（±1個pH單位）揮發性揮發性揮發性揮發性揮發性非揮發性非揮發性非揮發性揮發性揮發性揮發性能否

用于注釋質譜是是是是是否否否是是是離子對試劑，能抑制MS信號，在0.02%~0.1%

范圍內使用。與醋酸銨鹽一起使用時緩沖能力非常強。在0.1%~1.0%范圍內使用。與甲酸銨鹽一起使用時緩沖能力非常強。在0.1%~1.0%范圍內使用。在1~10 mM范圍內使用。

注：其鈉鹽或鉀鹽無揮發性。在1~10 mM范圍內使用。

注：其鈉鹽或鉀鹽無揮發性。常用的低pH值緩沖液，具有良好的UV透光率。pH值大于7時，需要降低柱溫/濃度并使用保護柱，

以盡可能延長使用壽命。pH值大于7時，需要降低柱溫/濃度并使用保護柱，

以盡可能延長使用壽命。通常在10 mM或更低濃度下使用。在5~10 mM范圍內使用（進行MS分析時，需保持源溫度> 150 ?C）。用氨水或醋酸調節pH值。pH為10時具有良好的緩沖容量。

注：請使用碳酸氫銨(NH4HCO3)，而不是碳酸銨((NH4)2CO3)。在1~10 mM范圍內使用。在1~10 mM范圍內使用。需要降低柱溫/濃度并使用保護柱，以盡可能延長使用壽命。兩性離子緩沖液，兼容乙腈，在1~10 mM范圍內使用。氣味小。兩性離子緩沖液，比硼酸鹽緩沖液更能延長色譜柱

使用壽命。在1~10 mM范圍內使用。兩性離子緩沖液，兼容乙腈，在1~10 mM范圍內使用。氣味小。在0.1%~1.0%范圍內使用。僅在采用醋酸滴定時具有揮發性（用鹽酸或磷酸時沒有）。

在DNA分析(pH 7~9)中用作離子對試劑。

溫和型緩沖液，可延長色譜柱使用壽命。揮發性揮發性非揮發性非揮發性非揮發性揮發性非揮發性是是否否否是否10.711.39.7–11.710.3–12.3揮發性揮發性是是

注：在pH、溫度和/或壓力的極值下運行會縮短色譜柱使用壽命。XBridge XP和XBridge Premier 2.5 μm BEH色譜柱5

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維護和使用手冊 ]IV. 色譜柱清洗、再生和存放a. 清洗與再生如果發生峰形改變、譜峰分叉、出現肩峰、保留時間改變、分離度變化或柱壓升高，則可能說明色譜柱受到污染。通常情況下，用純有機溶劑進行沖洗（小心避免緩沖液出現沉淀）就足以去除污染物。如果沖洗不能解決問題，可采用以下清洗和再生步驟灌注色譜柱。請根據樣品和/或您認為污染色譜柱的物質的性質，選擇與之匹配的常規清洗方法（見表3）。請使用20倍柱體積的溶劑沖洗色譜柱。升高柱溫可提高清洗效率。如果清洗和再生之后色譜柱性能仍然很差，請致電當地的沃特世辦事處獲得更多支持。

用50:50乙腈/水沖洗BEH HILIC色譜柱，去除極性污染物。如果此沖洗操作不能解決問題，可用5:95乙腈/水灌注色譜柱。要清洗BEH Amide色譜柱中的極性污染物，請運行10 min內水從0增加到100%的梯度。請注意，隨著水的比例上升，柱壓也將迅速增大。在含水量大于60%的條件下運行時，請降低流速。必要時請重復該操作。表3. XBridge BEH色譜柱的推薦pH和溫度限值色譜柱BEH C18BEH C8BEH苯基BEH Shield RP18BEH HILIC

BEH Amide粒徑2.5 μm2.5 μm2.5 μm2.5 μm2.5 μm2.5 μm孔徑130 ?130 ?130 ?130 ?130 ?130 ?表面積185 m2/g185 m2/g185 m2/g185 m2/g185 m2/g185 m2/gpH限值1–121–121–122–111–92–11溫度限值低 pH80 °C60 °C80 °C50 °C60 °C90 °C高 pH60 °C60 °C60 °C45 °C45 °C90 °C表面3.1 μmol/m23.1 μmol/m23.0 μmol/m23.2 μmol/m2—7.5 μmol/m2碳含量%17.712.814.516.6—12

表4. 反相色譜柱清洗順序極性樣品1.水2.甲醇3.四氫呋喃(THF)4.甲醇5.水6.流動相非極性樣品*1. 異丙醇（或適當比例的異丙醇 /水混合 溶液**）2. 四氫呋喃(THF)3. 二氯甲烷4. 己烷5. 異丙醇（然后使用適當比例的異丙醇/水 混合溶液**）6. 流動相蛋白質樣品選項1：重復進樣等份的二甲基亞砜 (DMSO)選項2：使用10%~90% B的梯度，其中：

A = 0.1%三氟乙酸(TFA)水溶液；B = 含0.1%三氟乙酸(TFA)的乙腈(CH3CN)溶液選項3：使用7 M鹽酸胍或7 M尿素沖洗色譜柱* 在使用THF或正己烷之前，確保系統與這些溶劑兼容。只有在利用純反相有機溶劑（如乙腈）無法清洗色譜柱時，方可考慮使用諸如THF或正己烷 之類的溶劑。降低流速，使用較低的操作溫度并限制系統與THF和/或己烷的接觸。** 使用低有機溶劑含量的溶液，避免出現緩沖液沉淀。XBridge XP和XBridge Premier 2.5 μm BEH色譜柱6

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維護和使用手冊 ]b. 存放如果反相色譜柱需要在室溫下存放超過四天，應將其保存于100%乙腈中。對于高溫應用，請在使用后立即用100%乙腈保存色譜柱，盡可能延長色譜柱使用壽命。切勿使用緩沖洗脫液保存色譜柱。如果流動相中含有緩沖鹽，則先用10倍柱體積（常規色譜柱體積請參見表1）的HPLC級水沖洗反相XBridge BEH色譜柱，再用100%乙腈替換柱內的水，然后儲存。如果不執行這個中間步驟，在引入100%乙腈時，色譜柱內可能會出現緩沖鹽沉淀。先用100%水梯度沖洗至100%乙腈，沖洗掉BEH Amide色譜柱中所有的水相溶劑，然后用100%乙腈進行儲存。將色譜柱完全密封，防止溶劑蒸發而導致柱床變干。如果BEH HILIC色譜柱需要存放超過四天，應將其保存于95:5乙腈:水中。切勿使用緩沖液保存色譜柱。如果流動相中含有緩沖鹽，則用10倍柱體積的95:5乙腈:水沖洗色譜柱（常規色譜柱體積請參見表1）。注：如果色譜柱運行了含甲酸鹽（如甲酸銨、甲酸等）的流動相，并且之后使用100%乙腈進行沖洗，那么在重新安裝色譜柱并再次運行含甲酸鹽的流動相時，柱平衡花費的時間可能略長。V. eCord智能芯片技術

（可能并非所有色譜柱配置都適用）a. 簡介eCord智能芯片可記錄色譜柱在整個使用壽命期間的性能歷史。eCord將永久性地安裝在色譜柱上，確保色譜柱在從一臺儀器轉移到另一臺儀器時，其性能記錄能夠得到完整保存。

eCord智能芯片圖3. eCord智能芯片。在生產時，溯源和質量控制信息將被下載到eCord中。這些信息存儲到芯片中之后，就不再需要紙質COA報告。用戶安裝色譜柱后，軟件會自動將重要參數下載到保存于芯片的色譜柱歷史文檔中。在本手冊中，我們將介紹eCord如何為以下各方面提供解決方案：輕松追蹤色譜柱的歷史信息，減少繁瑣的文書工作，確保儀器中安裝的色譜柱性能良好，從而為用戶消除顧慮。插入柱溫箱

側面的eCord圖4. 插入柱溫箱側面的eCord。b. 安裝將色譜柱安裝到柱溫箱中。將eCord插入柱溫箱的側面。eCord插入柱溫箱后，Empower?和MassLynx?軟件將提供色譜柱的識別信息和總體使用信息，用戶即可通過計算機查看色譜柱信息。

XBridge XP和XBridge Premier 2.5 μm BEH色譜柱7

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維護和使用手冊 ]c. 生產信息圖5. eCord芯片可為用戶提供填料批次QC測試結果概覽。

d. 色譜柱使用信息eCord芯片可為用戶提供色譜柱的使用數據。屏幕上方標識了色譜柱的填料類型、尺寸和序列號。色譜柱總體使用信息包括樣品總數、進樣總數、樣品組總數、首次進樣日期、末次進樣日期、最大壓力和最高溫度。此信息還將按樣品組詳細記錄色譜柱歷史，包括開始使用日期、樣品組名稱、用戶名稱、系統名稱、該樣品組的進樣次數、該樣品組的樣品個數、該樣品組的最大壓力和最高溫度，以及該色譜柱是否滿足基本的系統適用性要求。eCord芯片最多可存儲50個樣品組。VI. 其他信息a. 延長XBridge BEH色譜柱使用壽命的技巧1.

為了盡可能延長XBridge BEH色譜柱的使用壽命，請密切關注以下方面：水的品質（包括水純化系統）溶劑品質流動相的制備、儲存和使用期限樣品、緩沖液和流動相的溶解性樣品質量和制備2. 建議通過在工作流程中加入質量控制(QC)參比物質來監控系統的運行狀況。（請參閱720004535en）

3. 出現問題時，往往只需要糾正一個不當的操作。

圖6. eCord芯片可為用戶提供生產商進行色譜柱QC測試的條件和結果。具體信息包括

色譜柱測試所采用的流動相、

運行條件和分析物。此外，

色譜柱隨附QC結果和合格證。圖7. eCord芯片提供的色譜柱使用信息示例。4. 請務必記住：使用在線過濾器裝置，或者優選VanGuard

保護柱。盡可能避免使用100%水性流動相，以阻止細菌滋生。每24~48小時更換一次水性流動相（如果必須使用100%水性流動相）。

每24~48小時需將舊的100%水性流動相丟棄以阻止細菌滋生。

每次向流動相A添加5%~10%有機改性劑，

以調節梯度曲線。用0.2 μm濾膜過濾流動相的水相部分。維護水純化系統，使其保持良好的工作狀態。

XBridge XP和XBridge Premier 2.5 μm BEH色譜柱8

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維護和使用手冊 ]盡可能只使用超純水(18 MΩ·cm)和優質溶劑。使用HPLC級水，而不是UPLC級水。

考慮樣品前處理（如固相萃取、過濾等）。5. 避免事項（在可能的情況下）：100%水相流動相（如果可能）HPLC級瓶裝水“添加”流動相，或將“新”流動相加入到“舊”流動相中

使用舊置的水性流動相。切記每24~48小時徹底沖洗流動相儲液瓶，并制備新鮮流動相磷酸鹽緩沖液與高濃度乙腈（如> 70%）結合使用，可能會出現沉淀。6. 請勿在觀察到柱壓過高或峰分裂時便認定是由于色譜柱失效所引起。請通過檢查以下問題調查色譜柱出現故障的原因：柱壓流動相、細菌、沉淀和/或樣品

譜峰分叉樣品質量進樣溶劑的強度7. 為了降低流動相發生污染或降解的可能性，每次請僅制備分析所需的流動相并將多余的流動相保存在冷藏環境下。8. 流動相相關問題：是否在使用100%水性流動相？能否在流動相

A中加入少量有機改性劑？是否要使用0.2 μm濾膜過濾水性流動相？流動相配了多久了？是否需要在儲液瓶上注明制備日期？每24~48小時需添加流動相還是制備新鮮流動相？水的質量如何？水的質量最近有變化嗎？水純化系統是如何工作的？最后一次維護是什么時候？是否在使用pH 7的磷酸鹽緩沖液（在此條件下極易滋生細菌）？9. 樣品相關問題：如果以流動相配制的純標準品進樣，是否要注意這些

問題？如果按照樣品前處理方法（如SPE、過濾等）用水制備標準品，是否仍要注意這些問題？樣品質量是否隨時間變化？b. BEH HILIC色譜柱入門1. 由于BEH HILIC色譜柱不使用鍵合相，因此pH操作范圍為1~9， 操作溫度上限為45?C。2. 與其他液相色譜柱一樣，BEH HILIC色譜柱在pH、壓力和 溫度的極值下運行會縮短色譜柱使用壽命。色譜柱平衡1. 初次使用本色譜柱時，用50倍柱體積的50%乙腈: 50%水溶液 （含最終濃度為10 mM的緩沖液）沖洗色譜柱。

2. 首次進樣之前，用20倍柱體積的流動相（初始條件）平衡 色譜柱。3. 如果采用梯度條件，在進樣之間用8~10倍柱體積的流動相 平衡色譜柱。

4. 色譜柱平衡不當會導致保留時間漂移。

流動相注意事項1. 流動相或梯度中應始終保持至少含有3%的極性溶劑（例如， 3%水/3%甲醇或2%水/1%甲醇等）。這樣可以確保XBridge

BEH顆粒始終保持水合狀態。2. 流動相或梯度中應始終保持至少40%的有機溶劑（例如乙腈）。3. 避免在HILIC流動相中使用磷酸鹽緩沖液，以防出現沉淀， 但可以使用磷酸。4. 相較于甲酸或醋酸等添加劑，使用諸如甲酸銨或醋酸銨的 緩沖液可獲得重現性更好的結果。如果只能使用添加劑 （例如甲酸等）而不是緩沖液，請使用0.2% (v:v)的濃度， 而不是0.1%。5. 為了獲得理想峰形，應始終保持流動相/梯度中含有濃度為 10 mM的緩沖液。XBridge XP和XBridge Premier 2.5 μm BEH色譜柱9

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維護和使用手冊 ]進樣溶劑1. 如果可能，進樣溶劑應使用95%乙腈。極性溶劑（即水、 甲醇和異丙醇）應減少到總體積的25%。2. 通用的進樣溶劑為75:25乙腈:甲醇，該溶劑可以很好地平衡 分析物溶解性和峰形。3. 請避免進樣溶劑中含水和二甲基亞砜(DMSO)，這些溶劑將 導致非常差的峰形。4. 通過反相固相萃取(SPE)用乙腈置換掉水或DMSO。如果無法 實現，則用有機溶劑稀釋水或DMSO。其他技巧1. BEH HILIC色譜柱專用于保留極性非常強的堿性化合物，而 對于酸性、中性和/或非極性化合物的保留性能有限。

2. 分析小分子(< 200 Da)強極性堿性化合物時，理想流速范圍 為0.4~0.8 mL/min。3. 相較于Atlantis? HILIC硅基HPLC色譜柱，BEH HILIC色譜柱 在梯度分析中的保留性降低20%，在等度分析中的保留性 降低35%~65%。這是因為BEH顆粒表面的硅烷醇殘基濃度 更低。4. 切記水在HILIC分析中是非常強的溶劑。因此，必須去除或 盡可能減少進樣溶劑中的水。5. 初步探索色譜條件時，可運行95%乙腈至50%乙腈的梯度。 若無保留，可運行95:3:2乙腈:甲醇:水相緩沖液的等度條件。6. 可使用諸如甲醇、丙酮或異丙醇之類的極性溶劑代替水以 增強保留性能。7. 如果使用ACQUITY UPLC系統，弱洗針液應嚴格按照初始 流動相條件中的有機相百分比配制，否則分析物峰形或 保留性能可能會受到影響。8. 建議通過在工作流程中加入HILIC質量控制(QC)參比物質來 監控系統的運行狀況。（請參閱720004535EN）。

c. BEH Amide色譜柱入門操作范圍1. BEH Amide色譜柱可在pH 2~11的HILIC條件下運行常規分析， 操作溫度可達90?C。

2. 和其他LC色譜柱一樣，在pH、壓力和溫度的極值下運行會 縮短色譜柱使用壽命。

色譜柱平衡初次使用本色譜柱時，用50倍柱體積的60%乙腈:40%水溶液（或初始條件）沖洗色譜柱。首次進樣之前，用20倍柱體積的流動相（初始條件）平衡色譜柱。如果采用梯度條件，在進樣之間用8~10倍柱體積的流動相平衡色譜柱。色譜柱平衡不當會導致保留時間漂移。

流動相注意事項1. 流動相或梯度中應始終保持至少3%的極性溶劑（例如， 3%水、3%甲醇或2%水/1%甲醇等）。2. 推薦使用含緩沖液的流動相而不是添加劑。為獲得理想分析 結果，應始終保持色譜柱上的緩沖液濃度至少為10 mM。3. 如果要使用添加劑，建議始終保持色譜柱上的添加劑濃度 至少為0.2%。4. 流動相或梯度中應始終保持至少40%的有機溶劑（例如乙腈）。5. 水相溶液濃度大于60%時，應使用較低的流速，避免柱壓 過高。此要求適用于所有的水相溶液清洗步驟。6. 避免在HILIC流動相中使用磷酸鹽緩沖液，以防出現沉淀， 但可以使用磷酸。進樣溶劑1. 如果可能，進樣溶劑應盡可能接近流動相組分（如果是等度 分析）或起始梯度條件。除非安裝了正己烷/四氫呋喃兼容 性套件，否則不應將丙酮用作樣品溶劑/稀釋劑。XBridge XP和XBridge Premier 2.5 μm BEH色譜柱10

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維護和使用手冊 ]2. 通用的進樣溶劑為75:25乙腈:甲醇，該溶劑可以很好地平衡 分析物溶解性和峰形。分離在有機溶劑中溶解度不高的糖類 時，允許樣品中含有濃度較高的水相溶劑。使用50:50乙腈:水 可獲得滿意的結果。3. 進樣溶劑對峰形的影響應通過實驗確定。在某些情況下， 進樣水（或高含水量溶液）可能并不會對峰形造成不利影響。

其他技巧1. 初步探索色譜條件時，可運行95%乙腈至50%乙腈的梯度。 若無保留，可運行95:3:2乙腈:甲醇:水相緩沖液的等度條件。2. 可使用諸如甲醇、丙酮或異丙醇之類的極性溶劑代替水以 增強保留性能。3. 確保弱針清洗溶劑/清除溶劑采用的是起始流動相（即高比例 有機相），否則會對峰形造成不利影響。典型針清洗條件： 800 μL強清洗液(20:80 ACN/H2O)，500 μL弱清洗液(75:25

ACN/H2O)。4. 除非安裝了正己烷/四氫呋喃兼容性套件，否則不應將丙酮 用作樣品溶劑/稀釋劑。分離糖類的技巧1. 如果分離不含還原糖（如下文所示）的糖類或含糖化合物， 請遵循前文的一般建議。2. 如果分離還原糖，請查看以下信息。3. 還原糖可以發生變旋，導致α環和β環形式的糖（端基異構 體）分離，這是一種不良分離。4. 升高溫度和pH值可使端基異構體坍縮成一個峰：5. 在35 ?C下使用高pH（0.2%三乙胺(TEA)或0.1%氨水(NH4OH)）， 和/或6. 在高溫下(> 80 ?C)使用0.05% TEA (>80 ?C)。7. 分離還原糖（例如果糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、阿拉伯糖、 甘油醛等）時，請注意遵循以下建議。否則會導致這些分析 物出現分裂峰（端基異構體分離）：a. 以慢流速運行（例如，在2.1 x 50 mm色譜柱上流速設置 為0.10~0.13 mL/min），促進端基異構體坍縮。b. 色譜柱較長時，可采用較高的流速（例如0.3 mL/min）。 和所有LC分離一樣，理想流速應通過實驗來確定。c. 向兩個流動相（例如A2、B2等）儲液瓶中加入三乙胺 (TEA)或氨水(NH4OH)改性劑。d. 對于單糖和/或二糖的UPLC/ELSD分離，典型的等度 UPLC條件包括：i. 含有0.2% TEA的75%乙腈(ACN)，35 ?C，0.13 mL/min， 2.1 x 50 mm BEH Amide色譜柱；

ii. 含有0.05% TEA的77%丙酮，85 ?C，0.15 mL/min， 2.1 x 50 mm BEH Amide色譜柱；iii. 含有0.2% TEA的75% ACN，35 ?C，0.2 mL/min， 2.1 x 100 mm BEH Amide色譜柱。e. 對于更復雜的糖類混合物（例如多糖）的UPLC-ELSD分 離，典型的梯度UPLC條件包括（流動相A和B中都需要 添加TEA改性劑）：i. 10 min內梯度從80%變化至50% ACN（含0.2% TEA）， 35 ?C，0.13 mL/min，2.1 x 100 mm BEH Amide色譜柱， 或使用2.1 x 150 mm BEH Amide色譜柱（流速升至 0.3 mL/min）；ii. 10 min內丙酮從80%變化至55%（含0.05% TEA）， 85 ?C，0.15 mL/min，2.1 x 100 mm BEH Amide色譜柱。f. 對于單糖和二糖的UPLC-MS分離，典型的等度UPLC條件

包括：i. 含有0.1% NH4OH的75% ACN，35 ?C，0.13 mL/min， 2.1 x 50 mm BEH Amide色譜柱。g. 對于更復雜的糖類混合物（例如多糖）的UPLC-MS分離， 典型的梯度UPLC條件包括（流動相A和B中都需要添加 NH4OH改性劑）：i. 10 min內梯度從75%變化至45% ACN（含0.1% NH4OH）， 35 ?C，0.2 mL/min，2.1 x 100 mm BEH Amide

色譜柱。XBridge XP和XBridge Premier 2.5 μm BEH色譜柱11

[ CARE AND USE MANUAL ][

維護和使用手冊 ]6. 更復雜的樣品混合物可能需要使用梯度條件和/或更長的 UPLC色譜柱。7. 如果在一種或多種流動相中使用了丙酮，請勿使用丙酮作為 樣品稀釋劑或針清洗溶劑。有關樣品稀釋劑建議和針清洗 溶劑/灌注溶劑建議的其他技巧(＃3)，請參閱進樣溶劑部分。e. 考慮使用VanGuard BEH Amide保護柱保護UPLC色譜柱。8. 含糖樣品的典型樣品前處理建議如下：a. 液體樣品i. 使用50:50 ACN/H2O稀釋。ii. 使用0.45 μm或0.22 μm針式過濾器過濾（如有必要）。b. 固體樣品

i. 稱取樣品(~3 g)置入50 mL離心管中。ii. 加入25 mL 50:50 ACN/H2O，機械混合均勻。iii. 在3200 rpm下離心30 min。iv. 收集上清液，使用0.45 μm或0.22 μm針式過濾器過濾 （如有必要）。f. 建議通過在工作流程中加入HILIC質量控制(QC)參比物質 來監控系統的運行狀況。（請參閱720004535en）。c.

視樣品和/或分析物濃度而定，可能需要對樣品進行額外 稀釋。d. 更復雜并且/或者分析物濃度更低的樣品可能需要額外的 樣品前處理步驟（例如固相萃取(SPE)）。VII. 注意事項根據用戶應用不同，這些產品可能在使用后被歸類為危險品，因此應當由經過培訓、有能力處理此類物質的專業實驗室人員使用。產品的安全使用與處置由采購方和用戶全權負責。如需本產品的安全數據表(SDS)，請訪問/sds。掃一掃，關注沃特世微信沃特世科技(上海)有限公司上海辦公室：************北京辦公室：************廣州辦公室：************Waters China Limited

Waters、The Science of What's Possible、XBridge、ACQUITY、UPLC、eCord、VanGuard、MaxPeak、Arc、Oasis、Sep-Pak、Empower和MassLynx是沃特世公司的商標。所有其他商標均為其各自所有者的資產。?2022 Waters Corporation.中國印刷 2022年6月，修訂版E 720004162ZH IH-PDF香港辦公室：852 - 3921 5239免費售后服務熱線：800 (400) 820